人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及向肝臟樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及向肝臟樣細(xì)胞分化的方法。
　　方法：將脂肪組織切成小于1mm3的碎片,用膠原酶Ⅰ消化離心法獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,然后以1×104/cm2的細(xì)胞濃度,接種于含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng);觀察原代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況;取第5代細(xì)胞接種于24孔板中,每天消化3個(gè)孔,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,取其平均數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;取第5代細(xì)胞,胰酶消化后,用流式細(xì)

2、胞儀檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原CD13、CD73、CD34、CD45和HLA-DR;取第5代細(xì)胞接種于6孔板中,實(shí)驗(yàn)組分別用誘導(dǎo)培養(yǎng)基向成脂及成骨方向誘導(dǎo),對(duì)照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),檢測(cè)其多向分化潛能;取第5代細(xì)胞,接種于培養(yǎng)瓶及24孔板中,實(shí)驗(yàn)組用含有ActivinA、HGF、FGF、EGF、OSM、DMSO等細(xì)胞因子的兩階段法肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng),對(duì)照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并觀察細(xì)胞形

3、態(tài)變化及生長(zhǎng)情況,于誘導(dǎo)至第13天時(shí),采用RT-PCR法檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá),采用PAS染色法檢測(cè)肝臟樣細(xì)胞糖原合成情況,采用細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)抗原的表達(dá)。
　　結(jié)果：用消化離心法分離獲取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞大小均勻,呈梭形的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞增殖良好;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明接種后第3天細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,第6天后生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期,體外能長(zhǎng)期培養(yǎng)存活,并保持不分化狀態(tài);流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明細(xì)胞高表達(dá)CD13、CD73,低表達(dá)C

4、D34、CD45及HLA-DR;并能被誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞;上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了人原代脂肪干細(xì)胞系。人脂肪干細(xì)胞經(jīng)成肝誘導(dǎo)后,細(xì)胞形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)槎嘟切位蝾悎A形。誘導(dǎo)至第13天時(shí),RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞高表達(dá)ALB、AFP、CY3P4肝細(xì)胞相關(guān)基因,而對(duì)照組細(xì)胞呈低表達(dá)及無(wú)表達(dá)狀態(tài);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PAS染色呈紅色陽(yáng)性表現(xiàn);細(xì)胞免疫組化證實(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞高表達(dá)肝細(xì)胞特異性抗體HepPar-1、AFP、CK18、CK19,與