穩(wěn)定表達TNF-α及其突變體基因的人源細胞模型的建立.pdf

1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一種重要的炎癥因子，主要由激活的單核/巨噬細胞產(chǎn)生。TNF-α在機體的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中起著重要作用，控制著細胞分化、增殖與凋亡。它以兩種形式存在：26kDa的膜型TNF-α（mTNF-α）與17kDa的可溶型TNF-α（sTNF-α），sTNF-α由mTNF-α酶解而來。兩型TNF-α通過與兩型受體（TNFR1與TNFR2）結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，但兩型

2、TNF-α的胞毒作用方式和機制不盡相同。此外，mTNF-α除了作為配體與TNFR結(jié)合后向靶細胞傳遞正向信號而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)外，還可同時作為受體向效應(yīng)細胞傳遞反向信號（reverse signaling）。
　　 本室前期工作已經(jīng)建立了能分泌含三種TNF-α基因（野生型TNF-α、膜型TNF-α突變體和分泌型TNF-α突變體）的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細胞。本研究首先培養(yǎng)這三株包裝細胞，分別收集高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染自身TNF-α表達

3、量極低的人骨肉瘤細胞系（MG63），用G418篩選兩輪得到穩(wěn)定表達wTNF-α、mTNF-α和sTNF-α蛋白的細胞模型，為進一步研究兩型TNF-α的生物學(xué)功能以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等提供實驗工具。
　　 一、鑒定MG63細胞TNF-α的表達
　　 同等條件下分別提取MG63細胞和HL-60細胞的總mRNA進行RT-PCR檢測，經(jīng)過35個循環(huán)后，取相同量的產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果證實：MG63細胞中TNF-αmRNA水平極低，明顯低

4、于HL-60細胞。同時，在相同條件下分別提取MG63細胞和HL-60細胞的總蛋白進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示HL-60細胞可見明顯的TNF-α條帶，MG63細胞僅出現(xiàn)一條微弱的條帶，而兩者的β-actin蛋白量一致，提示MG63細胞的TNF-α表達量很低。此外，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：MG63細胞的TNF-α表達量為0.53%；ELISA檢測其培養(yǎng)上清中表達的sTNF-α低于檢測水平。
　　 二、穩(wěn)定表達T

5、NF-α及其突變體細胞模型的建立
　　 復(fù)蘇本室前期工作建立的表達TNF-α及其突變體基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細胞克隆，收集高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染MG63細胞，經(jīng)過篩選建立了表達TNF-α及其突變體基因的三種細胞模型。用各種方法鑒定證實TNF-α及其突變體基因在MG63細胞中得到有效表達。FCM結(jié)果顯示：MG63/wTNF細胞表達TNF-α量達29.97%；MG63/mTNF細胞表達TNF-α的量高達70.84%；然而MG63

6、/sTNF細胞表面也有少量的TNF-α的表達（9.15%），可能是由于細胞表面的TNFR結(jié)合了部分培養(yǎng)上清中的sTNF-α所致。ELISA檢測證實MG63/wTNF細胞和MG63/sTNF細胞的培養(yǎng)上清中sTNF-α的含量很高，分別為437.16pg/ml、380.95pg/ml；而MG63/mTNF細胞的培養(yǎng)上清中sTNF-α的表達量低于檢測水平。免疫熒光結(jié)果顯示MG63/sTNF細胞表面有微弱的熒光，呈環(huán)狀分布；而MG63/wTNF

7、細胞和MG63/mTNF細胞可見有很強的綠色熒光。Western blotting檢測的結(jié)果表明：MG63/wTNF細胞可見有26kD的mTNF-α和17kD的sTNF-α，但sTNF-α的量遠遠低于mTNF-α，僅見微弱的條帶；MG63/mTNF細胞僅見明顯的26kD的mTNF-α的表達；MG63/sTNF細胞僅見微弱的26kD mTNF-α，但其培養(yǎng)上清中可見有明顯的17kD sTNF-α的表達。上述結(jié)果均提示這三種細胞模型建立成功

8、。
　　 三、TNF-α及其突變體的生物活性
　　 采用TNF-α敏感細胞株L929鑒定TNF-α及其突變體的生物學(xué)活性。將三種細胞株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取相同細胞數(shù)培養(yǎng)24～48h，收集培養(yǎng)細胞和上清分別與靶細胞細胞共孵育，進行TNF-α胞毒活性的檢測。結(jié)果顯示：固定的MG63/mTNF細胞具有胞毒活性（64.28%）；MG63/sTNF細胞的培養(yǎng)上清亦具有胞毒活性（30.65%）；MG63/wTNF細胞的固定細胞和培養(yǎng)

9、上清均有胞毒活性（37.79%、38.02%）。此外，細胞的胞毒效應(yīng)與其TNF-α的表達量呈正相關(guān)，并且胞毒效應(yīng)均能被TNF-α單抗所阻斷（p<0.01），提示其胞毒活性為TNF-α特異性的。
　　 四、細胞表達TNF-α基因的持久性檢測
　　 本研究的目的是建立穩(wěn)定表達目的基因的細胞模型，故為了觀察細胞表達目的基因的持久性，采用了FCM定期測定連續(xù)培養(yǎng)的細胞模型TNF-α表達量的改變。檢測結(jié)果顯示：在G418維持培養(yǎng)下

10、，細胞株經(jīng)過6次傳代培養(yǎng)約4周左右，TNF-α的表達量從86.23%下降至50%左右；而無G418維持培養(yǎng)的細胞株，經(jīng)過約5次傳代培養(yǎng)約2.5周左右，TNF-α的表達量下降至50%。
　　 此外，由于細胞克隆在長時間傳代培養(yǎng)后，目的基因的表達率明顯下降。為了維持較高表達目的基因的細胞克隆，將復(fù)蘇的細胞克?。‵CM檢測其TNF-α的表達率為21.29%）再次進行亞克隆篩選，從而獲得了目的基因表達較高的亞克隆，F(xiàn)CM檢測其mTNF-