水稻少分蘗突變體6635的遺傳鑒定及黃化突變體505ys的基因克隆.pdf

1、1.水稻少分蘗突變體6635的遺傳分析與基因定位
　　作物株型和產(chǎn)量密切相關(guān)，分蘗作為禾本科植物特有的分枝方式，是株型重要的構(gòu)成因素之一，分蘗數(shù)的多少?zèng)Q定植株有效穗數(shù)的多少，從而影響其單位面積產(chǎn)量。因此分蘗數(shù)目對(duì)于選育作物理想型群體、增加單位面積產(chǎn)量具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。水稻分蘗是單子葉植物分枝的模式系統(tǒng)，對(duì)其相關(guān)基因的研究，不僅有利于揭示水稻分蘗生長(zhǎng)的分子機(jī)制，同時(shí)還對(duì)提高水稻產(chǎn)量具有重要作用。
　　本試驗(yàn)利用化學(xué)誘變劑

2、EMS處理水稻粳稻品種中花11，獲得了一個(gè)穩(wěn)定遺傳的水稻少分蘗突變體6635，該突變體的分蘗數(shù)明顯少于野生型，一般只有3到4個(gè)分蘗。遺傳分析表明6635的突變性狀由1對(duì)隱性核基因控制。以6635/岡46B的F2代為定位群體，利用SSR和In/Del標(biāo)記將突變基因定位在水稻第4染色體兩個(gè)In/Del標(biāo)記H4和H5之間，遺傳距離分別為0.53cM和1.21cM，物理距離為5198kb。
　　2.水稻黃化突變體505ys的基因克隆及功能

3、分析
　　葉色突變是一種比較常見(jiàn)且容易識(shí)別的突變，葉色突變導(dǎo)致植株體內(nèi)光合色素代謝異常，從而影響其光合作用的正常進(jìn)行。葉色突變體是研究光合作用、葉綠素合成和降解以及葉綠體發(fā)育等的實(shí)驗(yàn)材料，還可作為標(biāo)記應(yīng)用于雜交育種中。萜類(lèi)化合物是由異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的化合物，它是所有原核和真核生物有機(jī)體中最豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物。作為萜類(lèi)化合物合成途徑之一，MEP途徑對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有非常重要的作用。研究水稻MEP途徑關(guān)鍵酶的相關(guān)基因，有助于

4、更好地闡述其分子作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)EMS誘變?nèi)毡厩绔@得一個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳的黃化突變體505ys，本試驗(yàn)在前期基因定位的基礎(chǔ)上對(duì)該突變體進(jìn)行基因克隆及功能分析，主要結(jié)果如下:
　　(1)突變體505ys的表型特征及其農(nóng)藝性狀:該突變體整個(gè)生育期均表現(xiàn)出黃化表型，測(cè)定其主要農(nóng)藝性狀顯示，與野生型相比，其株高、每株有效穗數(shù)和每穗著粒數(shù)均有所下降，其千粒重和結(jié)實(shí)率顯著下降，分別下降6.5％和9.8％。
　　(2)突變體505ys的光

5、合色素測(cè)定:分別在苗期和抽穗期測(cè)定其光合色素含量，結(jié)果顯示，突變體色素含量?jī)蓚€(gè)時(shí)期均顯著低于野生型，其總?cè)~綠素含量分別為1.78和1.36mg/g，分別比野生型下降29.92％和41.63％。
　　(3)透射電子顯微鏡分析:利用透射電子顯微鏡對(duì)生長(zhǎng)4周左右的突變體505ys及其野生型日本晴的植株相同部位的葉片進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示:與野生型相比，突變體葉肉細(xì)胞的形狀有較大的差異，葉綠體內(nèi)沒(méi)有明顯基粒片層垛疊、類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)紊亂以及出現(xiàn)很

6、多空泡。
　　(4)候選基因分析與克隆:前期工作將505ys定位在第2染色體長(zhǎng)臂約182kb的區(qū)間內(nèi)，通過(guò)候選基因的遴選，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)參與了MEP途徑，測(cè)序顯示該基因的DNA序列629位（對(duì)應(yīng)cDNA序列508位）堿基由C突變?yōu)門(mén)，氨基酸由亮氨酸(L)突變?yōu)楸奖彼?F），推測(cè)該突變可能是引起突變體505ys黃化的原因，暫命名為505YS。
　　(5)功能基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pC2300-acti

7、n-505YS，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將野生型基因505YS轉(zhuǎn)入突變體中，轉(zhuǎn)基因植株表型和光合色素含量均恢復(fù)正常;同時(shí)，將空載體pCAMBIA2300-actin轉(zhuǎn)入突變體中作為對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植株表型和光合色素含量均與突變體相同。說(shuō)明黃化表型是由505YS基因突變導(dǎo)致的。
　　(6)組織表達(dá)分析:RT-PCR分析在苗期和孕穗期各個(gè)組織器官中的505YS基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示該基因在根、莖、葉、幼穗以及葉鞘中均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量略高于其