AHAS酶突變體系的建立及其研究.pdf

1、由于不斷地向植物中是施加除草劑或是作用機(jī)理相同的除草劑的反復(fù)使用，導(dǎo)致雜草種群對(duì)除草劑產(chǎn)生了抗藥性，給防治和生產(chǎn)管理增加了難度。從大量所研究的高等植物的抗性生物型中所得到的AHAS酶基因序列表明，一般來(lái)說(shuō)，存在五個(gè)不連續(xù)的高度保留的抗性區(qū)域，這些區(qū)域中的氨基酸置換可能會(huì)產(chǎn)生抗性，這些突變使AHAS酶對(duì)除草劑的抑制作用不敏感。除了實(shí)驗(yàn)室的篩選外，所有雜草中建立在靶標(biāo)基礎(chǔ)上的對(duì)AHAS酶抑制劑的抗性都是由這五個(gè)保留區(qū)中任意某個(gè)基因突變所引起

2、的。 為了找到雜草中建立在靶標(biāo)AHAS酶基礎(chǔ)上的對(duì)AHAS酶抑制劑的抗性根源，開(kāi)發(fā)出新的農(nóng)藥體系克服雜草的抗藥性，我們利用Megaprimer PCR基因定點(diǎn)突變技術(shù)，在E.coli AHAS Ⅱ酶的五個(gè)不連續(xù)高度保留區(qū)域A-E區(qū)中分別引入了W464A、W464F、W464L、W464Q、W464Y；M460A、M460F、M460L、M460Q、M460N；A108L、A108Q；V99L、V99Y；A26L、A26P、A26

3、Q、A26Y基因點(diǎn)突變。通過(guò)PCR電泳分析、重組質(zhì)粒的雙酶切分析及測(cè)序鑒定，確證構(gòu)建成功了十八個(gè)Ecoli AHAS Ⅱ酶突變體。通過(guò)對(duì)E.coli AHAS Ⅱ野生型及突變酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定可以發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于底物(pyruvate)及三種輔助因子(FAD、ThDP、Mg<'2+>)有著截然不同的特征常數(shù)，這些位點(diǎn)上氨基酸的突變很可能引起了AHAS酶局部構(gòu)象的改變，構(gòu)象上的改變導(dǎo)致了與三種輔助因子特征常數(shù)的上的差異。 此外，也通過(guò)

4、E.coli AHAS Ⅱ野生型及突變酶對(duì)兩種咪唑啉酮類除草劑和11種磺酰脲類除草劑敏感性的研究，比較不同的突變酶對(duì)于同種除草劑敏感性的差別。研究發(fā)現(xiàn)不同的突變體對(duì)不同結(jié)構(gòu)的抑制劑敏感性是不一樣的，對(duì)所測(cè)試的磺酰脲和咪唑啉酮除草劑都表現(xiàn)出抗性。這可能是由于除草劑結(jié)合在野生型的AHAS酶的底物進(jìn)出的通道處，和這個(gè)通道上的氨基酸側(cè)鏈形成了很強(qiáng)的相互作用，因?yàn)槌輨┳柚沽说孜锏倪M(jìn)出，所以AHAS酶的活性就受到了抑制；但是如果這個(gè)通道處的某個(gè)氨