原代自體表皮細(xì)胞移植治療燒傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.為了尋求最佳的分離條件，設(shè)計(jì)不同胰蛋白酶濃度、不同消化時(shí)間分離大鼠表皮細(xì)胞。2.在進(jìn)行大鼠表皮細(xì)胞的最佳分離條件的基礎(chǔ)上，探討皮膚面積與表皮細(xì)胞數(shù)量的關(guān)聯(lián)性。并測定表皮細(xì)胞的面積。3.制作大鼠Ⅲ度燒傷模型，在前面工作的基礎(chǔ)上，設(shè)定不同的移植密度治療大鼠燒傷創(chuàng)面，并觀察創(chuàng)面愈合情況。探討原代自體表皮細(xì)胞移植治療燒傷的可行性，適宜的移植密度。 方法：1.最佳分離條件的測定采用3個不同消化酶濃度和3個不同的消化時(shí)間，設(shè)為9組

2、。免疫細(xì)胞染色鑒定，臺盼藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過MTT法間接測定活力細(xì)胞的數(shù)量，通過正交分析判定最佳的消化酶濃度和消化時(shí)間，即最佳分離條件。2.在最佳分離條件下分別消化不同面積的大鼠皮膚，分為5組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析皮膚面積與表皮細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)聯(lián)性。在24孔板里培養(yǎng)一定數(shù)量的表皮細(xì)胞，用顯微測微尺測定細(xì)胞面積。3.建立大鼠燒傷模型，分為治療組(A、B、C)和對照組(D)。治療組采用不同細(xì)胞移植密度治療，A組：6.0×104/cm2；B組：1.2

3、×105/cm2；C組：2.4×105c/m2。術(shù)后觀察各組大鼠的創(chuàng)面的愈合情況，觀察并記錄各組大鼠創(chuàng)面瘢痕愈合數(shù)量和收縮比例等。 結(jié)果：1、消化得到的細(xì)胞經(jīng)免疫染色證實(shí)了分離出的細(xì)胞為表皮細(xì)胞。未貼壁時(shí)細(xì)胞呈圓球型，貼壁后呈多角形，培養(yǎng)后呈鋪路石樣特征，為表皮細(xì)胞典型特征。各組臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)；MTT法測定活力細(xì)胞數(shù)量，兩個計(jì)數(shù)結(jié)果均經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)正交分析分析證實(shí)：最佳的消化酶濃度和時(shí)間是0.25％胰蛋白酶，16小時(shí)，即最佳分離

4、條件。2、不同面積大鼠皮膚經(jīng)最佳分離條件消化后分離得到的表皮細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，皮膚面積與表皮細(xì)胞成線性相關(guān)，并得到線性方程。表皮細(xì)胞接種到24孔板后，用顯微測微尺測量細(xì)胞參數(shù)，得到表皮細(xì)胞面積6540±450um2。3、移植后A組死亡一只，B組和C組均因感染導(dǎo)致移植失敗各一只。A組瘢痕愈合數(shù)9例；B組瘢痕愈合數(shù)1例；C組瘢痕愈合0例；D組均為瘢痕愈合15例。在創(chuàng)面收縮比例上D組達(dá)84.5％，A、B、C組分別為34.3％、20.1％

5、、18.9％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析瘢痕愈合：BC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有意義；收縮比例：BC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有意義。 結(jié)論：1.胰蛋白酶-EDTA消化法可以成功分離表皮細(xì)胞，經(jīng)鑒定為表皮細(xì)胞，并經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)形態(tài)和功能良好。正交分析結(jié)果提示：在冷消化法中最佳的消化酶濃度和消化時(shí)間是0.25％胰蛋白酶0.04％EDTA(1：1)，16小時(shí)。冷消化法真皮刮除法最佳的分離條件是以上的消化酶濃度和時(shí)間。2.實(shí)驗(yàn)