羊膜為載體培養(yǎng)的自體口腔粘膜上皮細(xì)胞移植治療兔角膜堿燒傷的實驗研究.pdf

1、本文將取自兔自體的口腔粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖，代替來源有限的角膜緣干細(xì)胞，并以羊膜為載體移植治療兔角膜堿燒傷所致的角膜緣干細(xì)胞缺損，通過與單純?nèi)ド掀ぱ蚰ひ浦脖容^治療效果，探討該術(shù)式的安全性和有效性，為嚴(yán)重角膜緣干細(xì)胞缺損的臨床治療提供實驗依據(jù)。 研究方法：21只新西蘭兔(2-2.5kg)麻醉后，每只選1眼無菌條件下1mol/LNaOH溶液接觸1min建立角膜堿燒傷動物模型。羊膜經(jīng)EDTA處理后去除其上皮細(xì)胞?？谇徽衬ど掀そM

2、織(4-6mm2)從兔口腔獲取，將組織塊置37℃培養(yǎng)箱30min，經(jīng)1.25g/L胰酶0.2g/LEDTA混合液消化分離、收集細(xì)胞。對收集的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，采用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(pH7.4)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到80﹪～90﹪融合時進(jìn)行消化傳代，繪制細(xì)胞生長曲線，按1×103個細(xì)胞/mm2面積接種于鋪有羊膜的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行氣-液培養(yǎng)(airlifting)，細(xì)胞培養(yǎng)2-3周后形成5-6層復(fù)層上皮后行移植手術(shù)。將堿燒傷角膜緣干

3、細(xì)胞缺損模型兔21只隨機(jī)分為對照組(controlgroup)，單純羊膜移植組(AMgroup)和口腔粘膜上皮細(xì)胞羊膜移植組(AM+cellgroup)，每組7只兔子7只眼，單純羊膜移植組和口腔粘膜上皮細(xì)胞羊膜移植組眼燒傷后第7天行移植手術(shù)，并對治療后的角膜進(jìn)行裂隙燈觀察、病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查。 研究結(jié)果：羊膜為載體進(jìn)行氣-液培養(yǎng)的兔口腔粘膜上皮細(xì)胞經(jīng)2-3周形成5-6層的復(fù)層上皮，分化良好，且與正常角膜上皮細(xì)胞相似。口腔粘

4、膜上皮細(xì)胞羊膜移植治療后兔角膜基本保持透明，無結(jié)膜上皮進(jìn)入，新生血管細(xì)?。徊±韺W(xué)檢查可見與正常角膜類似的復(fù)層上皮，上皮細(xì)胞，排列整齊，與基質(zhì)層連接緊密，偶可見炎細(xì)胞，未見明顯杯狀細(xì)胞和新生血管；AE-1染色陽性。單純?nèi)ド掀ぱ蚰ひ浦仓委熀蠼悄せ鞚幔律芟蚪悄ぶ醒肷L，角膜表面可見結(jié)膜上皮長入；病理學(xué)檢查可見排列不規(guī)則的復(fù)層上皮細(xì)胞，夾雜杯狀細(xì)胞，其下基質(zhì)可見炎細(xì)胞、紅細(xì)胞和新生血管AE-1染色弱陽性。對照組大部分角膜上皮脫落、基質(zhì)纖維

5、腫脹、變性、變薄、炎細(xì)胞浸潤、大量新生血管長入。 研究結(jié)論：在實驗中將兔自體口腔粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并以羊膜為載體移植到堿燒傷干細(xì)胞嚴(yán)重缺損的眼表，與單純羊膜移植組比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)后早期即可恢復(fù)角膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性，抑制角膜新生血管的形成，為嚴(yán)重干細(xì)胞缺損眼表疾病的治療提供了一條新途徑。由此推測可以將人自體口腔粘膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖、移植進(jìn)行眼表重建，從而治療由于各種原因引起的人角膜緣干細(xì)胞缺損。但是上述治療的遠(yuǎn)期療效，口腔