帕金森大鼠紋狀體提取液對骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)作用的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's Disease，PD)的主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進行性減少，引起黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺水平降低。服用左旋多巴制劑的多巴胺替代治療至今仍是最為有效的治療方法，但其遠(yuǎn)期療效欠佳，癥狀波動，異動癥以及精神癥狀長期困擾著患者和醫(yī)療人員。細(xì)胞移植是目前帕金森病治療的新方法之一，如何在體外獲得足量的多巴胺能神經(jīng)元一直是神經(jīng)科學(xué)界面臨的一個難題。胎腦移植有比較好的效果，但是由于倫理束縛和來源限制，不能

2、夠得到廣泛應(yīng)用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是骨髓內(nèi)的一種多潛能干細(xì)胞，在一定條件下，可分化為神經(jīng)細(xì)胞。它可以直接從個體骨髓中獲得，來源充足，取材方便，創(chuàng)傷小，且避免了移植技術(shù)難以逾越的移植排斥問題和倫理學(xué)的束縛，因此BMSCs定向誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元甚至是多巴胺能神經(jīng)元成為帕金森病研究領(lǐng)域的熱點。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的機制還不確定。研究者認(rèn)為內(nèi)在基因機制和種系限制以及細(xì)

3、胞的命運是可塑的，環(huán)境可以引起細(xì)胞多潛能作用的發(fā)揮。神經(jīng)組織或細(xì)胞微環(huán)境可以增強：BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的能力。紋狀體是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元主要投射部位，是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。動物實驗已證實將BMSCs移植到紋狀體，能夠改善帕金森病大鼠或小鼠的行為。其可能作用機制是：BMSCs具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的功能；BMSCs注入紋狀體后，在局部微環(huán)境的作用下分化為神經(jīng)細(xì)胞，如膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元等。又有體外實驗表明紋

4、狀體提取液對多巴胺能神經(jīng)元有促進存活的作用，對細(xì)胞的分化有促進作用，還可以促進細(xì)胞突觸生成。在進化的過程中，哺乳動物繼承了多方面的機制以保護自己應(yīng)對外來侵犯。帕金森病患者腦內(nèi)DA能神經(jīng)元70-80％丟失仍能保持正常運動，提示著一種自我保護機制。我們設(shè)想，帕金森大鼠紋狀體提取液可以促進BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，甚至分化為多巴胺能神經(jīng)元。我們進一步設(shè)想正常紋狀體(正常側(cè))提取液和：PD紋狀體(損傷側(cè))提取液兩者問具有誘導(dǎo)作用上的差異。因

5、此，我們進行了帕金森大鼠紋狀體提取液誘導(dǎo)BMSCs的嘗試，以期利用紋狀體的生理作用以及紋狀體提取液對細(xì)胞的促分化作用和對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用，誘導(dǎo)BMSCs分化成為神經(jīng)細(xì)胞甚至是多巴胺能神經(jīng)元。同時比較正常紋狀體提取液與PD紋狀體提取液作用上的可能差異性。 本實驗研究的目的：利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為BMSCs紋狀體移植治療帕金森病的機制提供直接依據(jù)。具體實驗步驟：1，幼年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增與生物性狀觀察；2，帕金森大鼠

6、紋狀體提取液對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。 第一部分幼年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)與觀察 目的：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過超微結(jié)構(gòu)觀察和免疫組織化學(xué)檢測探討細(xì)胞生物學(xué)特性。 方法：收集幼年大鼠骨髓細(xì)胞，利用貼壁培養(yǎng)法純化擴增。培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，相差顯微鏡及HE染色，掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron spe

7、cial enolase，NSE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。 結(jié)果：電鏡下細(xì)胞表面見大量微絨毛結(jié)構(gòu)，一些細(xì)胞有單個或多個突起樣結(jié)構(gòu)。多數(shù)細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)存在豐富的細(xì)胞器；胞核大而明顯，染色質(zhì)分布正常；細(xì)胞間連接較少，可見縫隙連接。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)陽性細(xì)胞15.05±3.

8、92％。 結(jié)論：貼壁培養(yǎng)法是體外培養(yǎng)大鼠BMSCs的穩(wěn)定可靠的方法體系。第三代大鼠BMSCs具有生長旺盛，增值能力強，分化程度低的特點；部分細(xì)胞可表達(dá)GFAP。 第二部分帕金森大鼠紋狀體提取液對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 目的：探討帕金森大鼠紋狀體提取液在體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的可能。 方法：建立單側(cè)(右側(cè))帕金森病大鼠模型，取出雙側(cè)紋狀體分別制成正常紋狀體(正常側(cè))提取液與PD紋狀體(損傷側(cè))提

9、取液，制成不同濃度含紋狀體液的無血清培養(yǎng)基(誘導(dǎo)液)。收集幼年大鼠骨髓細(xì)胞，利用貼壁培養(yǎng)法純化擴增獲取三代細(xì)胞進行實驗。MTT法分別檢測不同濃度紋狀體誘導(dǎo)液對BMSCs生長狀態(tài)的影響。取10％，60％，90％誘導(dǎo)液(共六組)培養(yǎng)BMSC，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)變化。于48小時后收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specialenolase，N

10、SE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，計數(shù)陽性率。 結(jié)果：相差顯微鏡下，部分細(xì)胞脫落，不再貼壁生長，懸浮于培養(yǎng)液中。仍然貼壁的細(xì)胞失去原有圓形或梭形外觀，為不規(guī)則的多邊形或長棒狀。有的細(xì)胞團簇樣存在，向四周伸出輻射狀或長或短的較粗的刺狀突起，還有的細(xì)胞單個薦在，胞體不規(guī)則，向周圍伸出單個或多個細(xì)長的突起

11、樣結(jié)構(gòu)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，誘導(dǎo)后正常紋狀體誘導(dǎo)液10％濃度組NSE陽性率為3.25±2.37％，GFAP陽性率為48.44±29.47％；60％濃度組NSE陽性率為20±8.62％，GFAP陽性率為54.60±33.14％；兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。PD紋狀體誘導(dǎo)液10％濃度組Nestin陽性率為12.23±5.57％，GFAP陽性率為55.56±30.23％；60％濃度組Nestin陽性率為11.92±4.01％，GFAP陽性率為55.

12、56±30.23％；兩組間亦沒有統(tǒng)計學(xué)差異。各誘導(dǎo)組TH表達(dá)均為陰性。 結(jié)論：帕金森大鼠紋狀體提取液可以引起B(yǎng)MSCs形態(tài)學(xué)改變。與第三代BMSCs相比，誘導(dǎo)后GFAP陽性細(xì)胞顯著增多，同時出現(xiàn)NSE，Nestin陽性細(xì)胞。 總論1．貼壁培養(yǎng)法是體外培養(yǎng)大鼠BMSCs的穩(wěn)定可靠的方法體系。第三代幼年大鼠BMSCs具有生長旺盛，增值能力強，分化程度低的特點；部分細(xì)胞表達(dá)GFAP。 2．帕金森大鼠紋狀體提取液可以引起