平陽霉素對斑馬魚早期血管發(fā)育的影響及其機制研究.pdf

1、嬰幼兒血管瘤是一種嬰幼兒出生后常見的良性腫瘤，多發(fā)于頭、頸等部位。由于其對容貌及重要器官的功能可能產(chǎn)生影響，臨床常予以干預(yù)治療。目前，局部注射平陽霉素來治療嬰幼兒血管瘤是臨床上常用治療手段之一，治療效果良好。平陽霉素是一類常用抗腫瘤抗生素，能有效的促進腫瘤組織凋亡和抑制腫瘤血管生長，體外細(xì)胞實驗表明平陽霉素可以通過激活p53基因，抑制血管的生成，但其對體內(nèi)血管的生成的影響、作用機制及途徑仍不清楚。由于血管瘤是由快速分裂的內(nèi)皮細(xì)胞形成血管

2、樣組織組成，與正常血管結(jié)構(gòu)相似，所以本文選用同樣血管結(jié)構(gòu)比較密集的斑馬魚腸系膜下靜脈進行實驗，通過研究平陽霉素對腸系膜下靜脈的發(fā)育的影響及機制為平陽霉素治療血管瘤及其作用機制提供依據(jù)。
　　目的
　　本實驗擬通過模式動物斑馬魚來研究平陽霉素對機體正常血管生成的影響及作用機制，以便為平陽霉素治療嬰幼兒血管瘤的機制及作用途徑提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.從1ng/ml到10ug/ml以10倍差距設(shè)置5個不同濃度

3、的平陽霉素試驗組，并設(shè)置PTU空白對照組，測定平陽霉素對斑馬魚96h的最大安全濃度以及24 h的100％最小致死濃度。縮小濃度范圍后進一步實驗測定平陽霉素對斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)。
　　2.根據(jù)LC50值，設(shè)置空白對照組、PTU對照組以及100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml共七組不同濃度平陽霉素的胚胎培養(yǎng)液分別孵育野生(AB)型斑馬魚卵96小時。每天換藥一次，統(tǒng)計每天斑

4、馬魚的存活數(shù)量。對存活的96hpf斑馬魚進行堿性磷酸酶血管染色處理，觀察不同濃度平陽霉素溶液對AB型斑馬魚幼魚腸系膜下靜脈的生長發(fā)育影響情況，拍照后測量最長血管長度后做統(tǒng)計分析。
　　3.在p53基因突變型斑馬魚雜合子交配后得F1代，提取F1代成魚基因組，進行PCR擴增后檢測p53基因突變與否，篩選出純合子。純合子交配后，按照方法2中平陽霉素濃度分組后實驗，記錄每天斑馬魚的存活數(shù)，對存活的96hpf斑馬魚進行堿性磷酸酶的血管染色處

5、理，觀察不同濃度平陽霉素溶液對p53基因突變型斑馬魚幼魚腸系膜下靜脈的生長發(fā)育影響情況，拍照后測量最長血管長度后及魚體體長做統(tǒng)計分析。
　　4.按照方法2中平陽霉素濃度分組后分別對AB型斑馬魚以及p53基因突變型斑馬魚胚胎孵育96h，用吖啶橙進行染色后觀察兩種斑馬魚的組織細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.平陽霉素96小時最大安全濃度為100ng/ml和24小時100％致死濃度1000ng/ml，半數(shù)致死濃度為421

6、.17ng/ml。
　　2.隨著平陽霉素濃度的升高，野生型斑馬魚的死亡率逐漸升高，且在濃度100ng/ml至400ng/ml時，其腸系膜下靜脈最長血管長度平均值及最長腸系膜下靜脈長度/魚體體長的平均值逐漸減小。此外，當(dāng)平陽霉素濃度大于200ng/ml時出現(xiàn)大量異位血管芽，且濃度越大而越加明顯。
　　3.隨著平陽霉素濃度的升高，p53基因突變型斑馬魚的死亡率逐漸升高，但對其腸系膜下靜脈最長血管長度平均值沒有明顯影響。
　

7、　4.平陽霉素對AB型斑馬魚的心臟及其他組織細(xì)胞具有凋亡作用，并且隨著平陽霉素濃度的增加逐漸加強，而對p53基因突變型斑馬魚的細(xì)胞凋亡作用不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.臨床上使用平陽霉素治療嬰幼兒血管瘤最好采用局部用藥并且應(yīng)當(dāng)控制好藥物濃度。
　　2.適宜濃度的平陽霉素對AB型斑馬魚的血管生長具有抑制作用。
　　3.平陽霉素對AB型斑馬魚腸系膜下靜脈生長的抑制作用是通過p53基因起作用的。
　　4.平陽霉素