氨基葡甘露聚糖抗流感病毒作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過(guò)觀察自行合成的一種表面帶陽(yáng)性電荷的大分子多糖-氨基葡甘露聚糖(aminoglucomannan，AGM)對(duì)質(zhì)粒脫氧核糖核酸(deoxynuocleic acid，DNA)構(gòu)象的影響，研究?jī)烧咴隗w外相互作用的機(jī)理和影響因素；進(jìn)而采用熒光胺標(biāo)記示蹤AGM在體外細(xì)胞培養(yǎng)中觀察其跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力并探究其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；最后在流感病毒(Influenza virus，IFV)感染的狗腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby CanineKidney

2、，MDCK)模型中，觀察AGM抗流感病毒的活性并初步研究其作用機(jī)理。 方法:1、根據(jù)瓊脂糖電泳條帶的改變來(lái)檢測(cè)AGM與質(zhì)粒DNA聚合后的情況，并與多種糖類進(jìn)行比較，改變．AGM濃度、溶液酸堿度(Power of hydrogen，PH)值、離子強(qiáng)度(NaCl濃度)、溫度條件及質(zhì)粒DNA種類，分析其對(duì)聚合過(guò)程的影響及相關(guān)機(jī)理；2、用熒光胺標(biāo)記AGM，將標(biāo)記所得的熒光衍生物分別與外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblood mo

3、nonuclear cells，PBMC)和人肝腫瘤細(xì)胞株(Human hepaton aline，HepG2)在CO<,2>培養(yǎng)箱中孵育，然后用熒光顯微鏡(紫外光作激發(fā)光)觀察細(xì)胞，證實(shí)AGM的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力并分析其可能的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；3、觀察AGM抗流感病毒的作用：(1)MDCK細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用空斑單位形成試驗(yàn)檢測(cè)IFV病毒滴度，選擇合適的病毒感染復(fù)數(shù)；(2)倒置顯微鏡下觀察AGM對(duì)流感病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathi

4、c effect，CPE)的抑制作用； (3)采用MTT定量比色法觀察AGM對(duì)細(xì)胞CPE形成和細(xì)胞存活率的影響；(4)空斑減數(shù)試驗(yàn)測(cè)定AGM處理前后對(duì)病毒滴度的影響，分析AGM抗IFV活性的效應(yīng)是在吸附入胞環(huán)節(jié)外還是在入胞后；(5)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測(cè)AGM對(duì)流感病毒NP基因復(fù)制的抑制作用；(6)MDCK-ELISA方法檢測(cè)AGM對(duì)流感病毒M蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果:1、AGM和質(zhì)粒DNA混合后，可使DN

5、A電泳條帶發(fā)生明顯的位移，發(fā)生位移的DNA量與AGM濃度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，且該作用與酶切作用不同，而與氨基半乳糖的作用相同，溶液PH值、離子強(qiáng)度及溫度亦可影響AGM與質(zhì)粒DNA作用；2、標(biāo)記上熒光胺的AGM溶液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PBMC和HepG2細(xì)胞共同孵育后，兩種細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)靛色熒光，且熒光的強(qiáng)度不依賴于標(biāo)記AGM在溶液中的濃度；3、在IFV感染的MDCK細(xì)胞模型中：(1)AGM能夠顯著抑制IFV引起的MDCK細(xì)胞的特異性CPE，且呈

6、劑量依賴關(guān)系，與利巴韋林抗IFV病毒的作用無(wú)顯著差異；(2)空斑減數(shù)實(shí)試驗(yàn)證實(shí)在病毒吸附環(huán)節(jié)和入胞后，AGM都能發(fā)揮抗病毒的作用；(3)AGM能夠降低IFV-NP基因復(fù)制和IFV-M蛋白的表達(dá)。 結(jié)論:1、AGM在適當(dāng)?shù)臈l件下有與DNA聚合并對(duì)質(zhì)粒DNA構(gòu)象產(chǎn)生影響，該作用可能與其分子結(jié)構(gòu)中的氨基有關(guān)；2、AGM能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能通過(guò)受體的介導(dǎo)；3、AGM和利巴韋林同樣具有抗流感病毒的作用，且無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用