大蒜油抗流感病毒作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　 流感是一種由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，具有發(fā)病快、傳染性強等特點，曾多次造成世界范圍的大流行，嚴重影響人們的日常生活和身體健康。對于流感的防治，目前還沒有安全性和有效性都較理想的方法。大蒜油有防治冠心病、酒精性脂肪肝、殺菌、抗癌、殺蟲等多種功效，其抗巨細胞病毒、腸道病毒、鼠肝炎病毒、生殖器皰疹的研究已經(jīng)有了初步進展，但大蒜油抗流感病毒作用的研究還未見報導。本研究通過體外培養(yǎng)的細胞和動物模型，對大蒜油的抗流

2、感病毒作用進行了研究，并對其機制進行了初步的探討。為大蒜油用于流感的防治提供了科學依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、流感病毒的增殖:將0.2mL人季節(jié)性H1N1流感病毒（以下簡稱流感病毒）接種于10日齡的雞胚尿囊腔內，于34℃孵育箱里孵育44～48h，每日照檢，收獲前放于4℃冰箱6h。無菌吸取尿囊液，接種于下一代雞胚，方法同上，直至尿囊液中流感病毒的血凝滴度＞1∶128。然后將符合條件的尿囊液混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?br

3、>　　 2、大蒜油抗流感病毒作用的體外研究:常規(guī)培養(yǎng)MDCK細胞，采用細胞病變法(CPE)和四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)，測定大蒜油對MDCK細胞的毒性，確定其最大無毒濃度(TC0)和流感病毒對MDCK細胞的半數(shù)細胞培養(yǎng)感染量(CCID50)。然后分預防作用組、直接作用組、抗病毒吸附組和抗生物合成組四種加藥方式，每種加藥方式中包括空白對照、病毒對照、溶劑對照[二甲基亞砜(DMSO)]、陽性藥對照（利巴韋林）和不同濃度的大蒜油實驗組，

4、分別計算大蒜油的抗流感病毒有效率(ER)和治療指數(shù)(TI)，并研究大蒜油在MDCK細胞株上的抗流感病毒作用。
　　 3、流感病毒感染小鼠模型的建立:取10只18～20g昆明小鼠，雄性，將50μL流感病毒滴鼻接種小鼠，4d后將小鼠處死，挑選感染體征嚴重者進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)檢測肺中的流感病毒RNA，將檢測陽性的肺上清在雞胚尿囊腔內擴增，將血凝滴度最高的含病毒尿囊液接種于下一代小鼠。比較各代小鼠對流感病毒的

5、適應情況，直至小鼠出現(xiàn)明顯的感染體征，取肺研磨制成勻漿，獲得流感病毒鼠肺適應株并檢測其對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。將10LD50的病毒液接種于小鼠，建立流感病毒的小鼠感染模型，觀察模型小鼠的一般活動狀態(tài)、體質量變化、肺部病變，HE染色觀察肺部病理切片，計算肺指數(shù)，F(xiàn)Q-PCR檢測病毒RNA。
　　 4、大蒜油對流感小鼠的預防作用和死亡保護作用:將小鼠隨機分為7個組，分別為空白對照、病毒對照、溶劑對照（玉米油）、陽性藥對照（鹽

6、酸金剛烷胺）、大蒜油低劑量組、大蒜油中劑量組和大蒜油高劑量組，首先構建小鼠流感病毒模型（除空白對照組）。然后根據(jù)分組不同灌胃給予不同受試物，逐日觀察大蒜油對感染流感病毒小鼠的一般活動狀態(tài)、體質量的影響。接種病毒7d后取肺，計算肺指數(shù)的差別，HE染色觀察肺部病變，F(xiàn)Q-PCR檢測肺中流感病毒RNA。接種病毒14d后計算各組染毒小鼠的死亡率和生存時間，判斷大蒜油體內抗流感病毒作用。
　　 5、大蒜油對流感小鼠的免疫功能的影響:將小鼠

7、隨機分為7個組，方法同4，觀察大蒜油對ConA刺激的淋巴細胞增殖功能、NK細胞活性的影響，測定小鼠血清中TNF-α，IFN-γ和IL-10的含量。
　　 6、統(tǒng)計學方法:使用excel數(shù)據(jù)庫和SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準均為α=0.05。
　　 結果:
　　 1、流感病毒在雞胚尿囊腔內傳代4次后，血凝滴度＞1∶128。
　　 2、大蒜油體外抗病毒實驗結果表明，48h后，流感病毒

8、對MDCK細胞的CCID50為10-3/0.1mL，大蒜油對MDCK細胞的TC0為0.13mg/L，半數(shù)中毒濃度(TC50)為5.87mg/L。大蒜油預防作用組抗流感病毒的最佳濃度為0.1mg/L，ER為72.5％，高于陽性藥對照（P＜0.05）;在直接作用組，抗流感病毒的最佳濃度為0.13mg/L，ER為51.4％，低于陽性藥對照(P＜0.05);抗病毒吸附組中，隨大蒜油濃度增加，抗病毒ER增加，最佳濃度為0.001mg/L，但是比陽

9、性藥對照低（P＜0.05）?？共《疚浇M的大蒜油的TI值最高，為7159，預防作用組、直接作用組和抗病毒吸附組中，大蒜油的TI值均高于陽性藥對照（P＜0.05）。
　　 3、將流感病毒在小鼠體內連續(xù)傳4代后，小鼠出現(xiàn)明顯感染體征，獲得了流感病毒鼠肺適應株，小鼠經(jīng)鼻的LD50為10-241/0.05mL。將10LD50的流感病毒鼠肺適應株滴鼻接種于小鼠后，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、皺毛蜷縮、食欲減退、活動遲緩等體征，70％的小鼠死亡;小鼠

10、肺部充血明顯、炎細胞浸潤，肺指數(shù)增大;FQ-PCR檢測流感病毒RNA結果均為陽性。成功建立了流感病毒感染的小鼠模型。
　　 4、大蒜油對流感小鼠的預防作用和死亡保護作用的實驗結果表明，與病毒對照組小鼠相比，灌胃大蒜油的小鼠一般狀態(tài)較好，狀態(tài)評分于第8d高于病毒對照（P＜0.05），體質量于第7d有回升趨勢。大蒜油組小鼠的肺指數(shù)有小于病毒對照組的趨勢，肺部病變較輕，流感病毒RNA量較少。大蒜油組小鼠死亡率較低，平均生存時間均長于溶

11、劑對照組(P＜0.05)。
　　 5、大蒜油對流感小鼠免疫功能影響的實驗結果表明，大蒜油中劑量組的小鼠ConA刺激的淋巴細胞轉化能力高于空白對照組、病毒對照組和溶劑對照組（P＜0.05），大蒜油高劑量組小鼠的NK細胞活性高于空白對照、病毒對照、溶劑對照、陽性藥對照和大蒜油低中劑量組（P＜0.05）。血清中TNF-α含量在各組之問差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），大蒜油低、中、高3個實驗組小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量均低于