單磷酰脂A預(yù)處理延遲性心肌保護作用的相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分單磷酰脂A預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌延遲性保護作用研究 目的:缺血預(yù)處理即是心肌經(jīng)過一次或幾次短暫缺血后，對隨后較長時間缺血損傷的耐受性增加的現(xiàn)象，它分早、晚兩個時段。早期時段從短暫缺血后數(shù)分鐘開始，持續(xù)2-3小時，而延遲階段是在缺血后12-24小時出現(xiàn)，并持續(xù)3-4天。由于缺血預(yù)處理延遲相持續(xù)時間長，加上臨床相關(guān)的藥劑也可誘導(dǎo)出預(yù)處理延遲相，因而，藥物預(yù)處理延遲相的研究可能更有臨床應(yīng)用前景，成為研究的熱點。本研究在探討

2、藥物單磷酰脂A是否可誘導(dǎo)出延遲性心肌保護作用的同時，應(yīng)用核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)等信息分子的抑制劑來重點探討這三者是否參與這一過程. 方法:健康雄性Wistar大鼠隨機分為6組(每組18只)：(1)正常對照組(NC)組：不做任何處理.(2)缺血再灌注組對照組：由舌靜脈滴入生理鹽水2ml，24h后結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，30min后松解，再灌注120min。(3)ML

3、A預(yù)處理(MLA-P)組：于缺血再灌注前24h由舌靜脈滴入MLA(450μ/kg，溶于2ml生理鹽水中)，持續(xù)5min，24h后同缺血再灌注組實驗方法。(4)DDTC+MLA組：于MLA應(yīng)用前10min應(yīng)用NF-κB抑制劑DDTC(150mg/kg)使用，腹腔注射，而后重復(fù)MLA-P組。(5)MLA-P+SMT組：先同MLA預(yù)處理組應(yīng)用藥物，再于第2天缺血再灌注前40min應(yīng)用iNOS的抑制劑SMT，分五次靜脈注射，8min一次，每次0

4、.05mg/kg(總量0.25mg/kg)，隨后重復(fù)I/R組。(6)MLA-P+NS-398組：先同MLA預(yù)處理組應(yīng)用藥物，再于第2天缺血再灌注前40min應(yīng)用COX-2的抑制劑NS-398(5mg/kg)，腹腔注射，隨后重復(fù)I/R組。再灌注結(jié)束時檢測各組心功能(LVSP、±dp/dt.max)、心肌梗死范圍，心肌細胞凋亡率(TUNEL法)。 結(jié)果:與NC組相比，I/R組心功能明顯惡化、心肌梗死明顯擴大、心肌細胞凋亡率明顯增多(

5、分別P＜0.01vsNC組)。與I/R組相比，MLA預(yù)處理組心功能明顯改善、心肌梗死范圍明顯減小、心肌細胞凋亡明顯減少(分別P＜0.01vsI/R組)。應(yīng)用DDTC、SMT、NS-398可完全阻斷MLA預(yù)處理的心肌保護作用，DDTC+MLA組、MLA-P+SMT組、MLA-P+NS-398組三組心功能、心肌梗死范圍、心肌細胞凋亡率同I/R組無顯著差別(分別P＞0.05vsI/R)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理誘導(dǎo)出了延遲性心肌保護作用，

6、可明顯改善預(yù)處理后24h缺血再灌注心臟功能，減小缺血再灌注心肌梗死范圍和細胞凋亡率。在此過程中，NF-KB、iNOS、COX-2三者可能起著重要作用。 第二部分iNOS、COX-2在單磷酰脂A預(yù)處理延遲相中的作用及相互關(guān)系研究 目的:本部分重點探討MLA預(yù)處理對大鼠心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達、兩者蛋白表達的影響以及iNOS、COX-2兩者的相互關(guān)系。 方法:選取健康雄性Wistar大鼠

7、36只隨機分為6組，正常對照組及MLA預(yù)處理2hr組、6hr組、10hr組、14hr組、24hr組。應(yīng)用RT-PCR方法檢測各時間點心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達。另選取健康雄性Wistar大鼠72只隨機分為4組，每組又分兩個亞組.1.正常對照組。2.MLA預(yù)處理組。3.MLA-P+SMT組。4.MLA-P+NS-398組。應(yīng)用免疫印跡法及酶聯(lián)免疫(EIA)法檢測處理后24hr各組iNOS、COX-2蛋白表達，心肌中前列腺

8、素類化合物及一氧化氮的量。 結(jié)果:未預(yù)處理心肌細胞內(nèi)iNOSmRNA及COX-2mRNA表達均較少，MLA預(yù)處理后2hr表達開始增多，6hr表達明顯增多(兩者分別約為未預(yù)處理心肌表達量的3.8倍和3倍)，10hr表達開始減少，14hr表達更少，MLA預(yù)處理后24hr兩者的表達恢復(fù)到預(yù)處理前水平。免疫印跡及EIA法檢測發(fā)現(xiàn)：MLA預(yù)處理明顯升高預(yù)處理后24hriNOS蛋白、COX-2蛋白表達(兩者分別約為未預(yù)處理心肌表達量的3.7

9、倍和3倍)，也明顯提高心肌iNOS活性以及心肌NO、PGE2、6-keto-PGF1α水平(P＜0.01vsNC)，用SMT、NS-398并不影響MLA預(yù)處理后iNOS、COX-2蛋白表達。應(yīng)用iNOS抑制劑SMT后，明顯抑制了預(yù)處理導(dǎo)致的iNOS活性以及NO、PGE2，6-keto-PGF1α水平的提高(P＜0.01vsMLA-P；P＞0.05vsNC)，而應(yīng)用COX-2抑制劑NS-398，卻不能影響預(yù)處理導(dǎo)致的iNOS活性以及NO量

10、的增加(P＞0.05vsMLA-P；P＜0.01vsNC)，但能明顯抑制PGE2，6-keto-PGF1α量的增加(P＜0.01vsMLA-P；P＞0.05vsNC)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理使得預(yù)處理后心肌中iNOSmRNA及COX-2mRNA表達迅速增加，預(yù)處理后(缺血再灌注前)兩者蛋白表達及其活性產(chǎn)物明顯增加。若分別抑制它們活性產(chǎn)物的增加，則MLA預(yù)處理的延遲相保護作用都會被取消。說明MLA預(yù)處理正是通過iNOS、COX-2兩

11、種基因的適度表達和激活而產(chǎn)生了延遲相保護作用，它們是MLA預(yù)處理過程中的重要保護物質(zhì)。同時發(fā)現(xiàn)，與預(yù)處理延遲相保護作用密切相關(guān)的前列腺素類化合物的活性依賴于iNOS的激活，這表明在MLA誘導(dǎo)的預(yù)處理過程中，在生理功能上iNOS居于COX-2的上游。 第三部分核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在單磷酰脂A預(yù)處理延遲相中的作用及與iNOS、COX-2關(guān)系研究 目的:探討NF-κB是否介導(dǎo)了單磷酰脂A預(yù)處理延遲保護作用的產(chǎn)生，并了

12、解NF-κB的阻斷劑對MLA預(yù)處理誘導(dǎo)iNOS、COX-2mRNA表達及蛋白表達的影響。 方法:選取健康雄性Wistar大鼠30只隨機分為5組：正常對照組、MLA預(yù)處理15min組、30min組、60min組、DDTC+MLA后30min組.應(yīng)用免疫印跡法及EMSA法檢測各時間點NF-κB的核轉(zhuǎn)錄及NF-κB活性。另選取健康雄性Wistar大鼠54只隨機分為三組：正常對照組(NCn=18)、MLA預(yù)處理(6hr亞組n=6，24h

13、r亞組n=12)、DDTC+MLA(6hr組亞組n=6，24hr亞組n=12)。應(yīng)用RT-PCR方法檢測正常對照組及預(yù)處理后6hr心肌iNOSmRNA、COX-2mRNA表達。應(yīng)用免疫印跡法及酶聯(lián)免疫法(EIA)法檢測正常對照組及預(yù)處理后24hriNOS、COX-2蛋白表達，心肌中前列腺素類化合物及一氧化氮的量。 結(jié)果:未預(yù)處理心肌細胞核內(nèi)P65蛋白水平及NF-κB活性水平都較低，預(yù)處理后15min可檢測到核內(nèi)P65蛋白水平及N

14、F-κB活性水平增高，在預(yù)處理后30min心肌細胞核內(nèi)P65蛋白量及NF-κB活性水平明顯增高并達到高峰(分別為正常組的2.8和4.1倍)，預(yù)處理后60min兩者都有所下降(分別為正常組的1.9和2.0倍)，120min兩者都基本回到正常組水平，同正常心肌組無明顯差別(P＞0.05vsNC)。DDTC+MLA組心肌核內(nèi)由預(yù)處理導(dǎo)致的P65蛋白的增高及NF-κB活性水平的增高均被阻斷，P65蛋白水平及NF-κB活性水平都較低，同正常心肌組

15、無明顯差別(P＞0.05，vsNC)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：預(yù)處理后6hriNOSmRNA、COX-2mRNA表達及24hr兩者蛋白表達均明顯增多，處理后24hNO、PGs量明顯增加(分別P＜0.01，vsNC)，而先應(yīng)用NF-κB抑制劑DDTC，兩者mRNA表達，24hr蛋白表達，NO、PGs量都明顯受到抑制(分別P＜0.01vsMLA-P，分別P＞0.05vsNC)。 結(jié)論:MLA預(yù)處理誘導(dǎo)了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB快速核傳移和激活，從而