轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3參與干細胞多能性基因OCT4轉(zhuǎn)發(fā)調(diào)控機理初探.pdf

1、干細胞(Stem cell，SC)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞。近年來干細胞領(lǐng)域的研究為疾病治療提供了嶄新思路，極大的推動了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。干細胞多能性維持與定向分化過程涉及特定基因表達的開啟與關(guān)閉，依賴于復(fù)雜而精細的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文以P19 EC細胞為體系，對干細胞多能性關(guān)鍵基因OCT4在干細胞分化早期的抑制表達機理作了初步探索。
　　轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3(Groucho-related gene3)屬于

2、Groucho輔助抑制因子(corepressor)家族，在胚胎發(fā)育及器官形成等生理過程中發(fā)揮重要作用。以往的研究表明，由于蛋白序列中不具備DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3通常被能結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子招募至靶基因的調(diào)控區(qū)域，進而可能通過改變?nèi)旧|(zhì)修飾狀態(tài)以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制功能。本文中使用多種手段考察了Grg3參與多能性基因OCT4轉(zhuǎn)錄抑制的機制。Grg3表達水平在P19細胞受維甲酸誘導(dǎo)向神經(jīng)分化的過程中維持不變，通過運用Grg3特異性

3、siRNA以及外源Grg3-V5融合蛋白高表達質(zhì)粒工具，人們發(fā)現(xiàn)P19 EC細胞中OCT4表達水平受到Grg3蛋白水平變化的調(diào)節(jié)，高水平的Grg3抑制OCT4表達，干擾Grg3則使OCT4表達水平上升。進一步的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约癈HIP實驗證實Grg3對OCT4的表達抑制是通過特異性結(jié)合在OCT4啟動子-3500bp～-3345bp區(qū)域來實現(xiàn)的。
　　轉(zhuǎn)錄因子FoxA1(Forkhead box A1)也叫HNF3α，屬于

4、叉頭蛋白家族(Forkheadfamily)并參與調(diào)節(jié)眾多生理過程。研究表明FoxA1是P19向神經(jīng)分化早期的關(guān)鍵因子，且在體外已被證明與Grg3存在蛋白-蛋白相互作用，本文中也通過免疫熒光共定位實驗在胞內(nèi)證實了這一點。OCT4啟動子-3500bp～-3345bp區(qū)域包含2個FoxA1結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，這2個位點的點突變將使Grg3對該啟動子區(qū)域活性的抑制作用消失。因此，F(xiàn)oxA1可能是OCT4轉(zhuǎn)錄抑制中招募Gr