結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄抑制因子SirR參與脅迫應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、結(jié)核病（Tuberculosis,TB）仍然威脅著全球人類的健康，2014年新增感染病例900萬(wàn)，150萬(wàn)人死于結(jié)核病，成為僅次于艾滋病的全球第二大傳染疾病(http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/）。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結(jié)核病的病原菌，它能夠在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)持留，持留結(jié)核分枝桿菌可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用以

2、及抗結(jié)核藥物。近年來(lái)，由于多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）、廣泛耐藥（extensively drug-resistant，XDR）甚至是完全耐藥（totally drug resistant tuberculosis，TDR）MTB的出現(xiàn)，MTB與HIV共感染增加，再加上缺乏抗結(jié)核新藥和疫苗，結(jié)核病形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻。因此，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)理的研究迫在眉睫。
　　結(jié)核分枝桿菌能夠通過(guò)多種機(jī)制逃逸宿主

3、免疫系統(tǒng)的殺傷，適應(yīng)不利環(huán)境。除了細(xì)胞壁含有獨(dú)特的蠟質(zhì)分枝菌酸，具有高度不透性，以及多種外排泵之外，結(jié)核分枝桿菌具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　金屬調(diào)控蛋白通過(guò)控制細(xì)菌中與金屬離子吸收，儲(chǔ)存和外排相關(guān)基因的表達(dá)，從而維持細(xì)菌金屬離子代謝的穩(wěn)定，其中DtxR（diphtheria toxin repressor）家族是最具有代表性的金屬調(diào)控蛋白之一。結(jié)核分枝桿菌中，DtxR家族包括兩個(gè)成員:IdeR（iron dependent re

4、pressor）和SirR（iron repressor），本課題主要以SirR為研究對(duì)象開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。SirR最初發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，控制毒力基因的表達(dá)。結(jié)核分枝桿菌中，SirR由Rv2788編碼，由于SirR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控依賴錳離子，并且調(diào)控與錳離子吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，被重命名為MntR。
　　為了研究Rv2788蛋白在脅迫應(yīng)答中的作用，我們分別構(gòu)建了能夠表達(dá)Rv2788蛋白的重組恥垢分枝桿菌（Ms_Rv2788）

5、以及空載體重組恥垢分枝桿菌（Ms_Vec）。研究發(fā)現(xiàn)，Rv2788蛋白沒(méi)有影響重組恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)速率，但改變了菌落形態(tài)。通過(guò)體外模擬恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞時(shí)面臨的壓力條件，發(fā)現(xiàn)Rv2788增強(qiáng)重組恥垢分枝桿菌的抗壓能力，對(duì)雙氧水、聯(lián)氨氧化壓力，SDS表面活性劑和酸性壓力更加耐受，同時(shí)增強(qiáng)了氯霉素、萬(wàn)古霉素和阿米卡星處理后的存活能力。GC-MS分析細(xì)胞壁的脂肪酸組分，發(fā)現(xiàn)重組菌 Ms_Rv2788的脂肪酸成分明顯上調(diào)，特別是C14:

6、1w5(t)，C14:0和 C16:1w7(c)。通過(guò)檢測(cè)溴化乙錠和尼羅紅的積累，發(fā)現(xiàn) Rv2788蛋白降低了重組恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性。這說(shuō)明Ms_Rv2788可能通過(guò)改變細(xì)胞壁的脂肪酸組分降低細(xì)胞壁的通透性，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)環(huán)境壓力以及抗生素的耐受能力。但是，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊現(xiàn)象：與空載菌相比，重組菌Ms_Rv2788對(duì)卷曲霉素更加敏感。熒光定量PCR檢測(cè)與卷曲霉素耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)Rv0039,Rv0812,Rv1286

7、三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，這表明Rv2788調(diào)控卷曲霉素耐受相關(guān)基因增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌對(duì)卷曲霉素的敏感性。
　　此外，熒光定量PCR檢測(cè)了Rv2788的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可能調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)whiB1,Rv0077。Rv2221。Rv2986和Rv1219五個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，而SOS反應(yīng)相關(guān)基因lexA則明顯上調(diào)表達(dá)。通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)到Rv2788能夠與上述下調(diào)基因的啟動(dòng)子片段結(jié)合，這說(shuō)明Rv2788

8、直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　綜上所述，本文主要研究了轉(zhuǎn)錄抑制因子Rv2788在壓力脅迫和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮的功能，首次報(bào)道了Rv2788可能直接或間接參與分枝桿菌脂肪酸代謝，改變細(xì)胞壁的脂肪酸成分和菌落形態(tài)，降低細(xì)胞壁的通透性，增強(qiáng)恥垢分枝桿菌的抗壓能力；調(diào)控卷曲霉素耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)卷曲霉素的敏感性；負(fù)調(diào)控多個(gè)基因，包括與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因whiB1和lexA。然而，Rv2788蛋白改變分枝桿菌細(xì)胞壁脂肪