SDF-1-CXCR4軸在肺癌轉(zhuǎn)移中作用與機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　與背景肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移是其治療失敗和患者死亡的主要原因。已有研究表明趨化因子及其受體與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能是通過(guò)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相似的機(jī)制參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本課題旨在研究趨化因子SDF-1及其受體CXCR4構(gòu)成的特異性軸在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用與機(jī)制，為肺癌轉(zhuǎn)移的防治提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　材料與方法：
　?。?）收集臨床非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織標(biāo)本60例，分

2、別取癌組織、癌旁組織及正常肺組織，進(jìn)行免疫組化和RT-PCR檢測(cè)其CXCR4的表達(dá)，分析肺癌組織與癌旁、正常肺組織間CXCR4表達(dá)的差異；按病理類(lèi)型、分化程度及臨床TNM分期分別進(jìn)行分組，分析CXCR4的表達(dá)與病理類(lèi)型、分化程度及臨床TNM分期的相關(guān)性。
　?。?）體外構(gòu)建pEGFP-C1-CXCR4質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞系，建立CXCR4過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞系（CXCR4-A549）。在CXCR4的特異性配體SDF-1的

3、誘導(dǎo)下，分別對(duì)CXCR4-A549與A549兩組細(xì)胞進(jìn)行體外趨化和侵襲實(shí)驗(yàn)，并建立裸鼠皮下接種肺癌細(xì)胞的動(dòng)物模型，分析上調(diào)CXCR4的表達(dá)后，對(duì)肺癌細(xì)胞體外遷移能力和體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移的能力的影響。
　?。?）為探討SDF-1/CXCR4在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制：①利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CXCR4-A549與A549兩組細(xì)胞的增殖和凋亡，分析上調(diào)CXCR4的表達(dá)后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響；②利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞鈣離子內(nèi)流強(qiáng)度，分析

4、SDF-1/CXCR4對(duì)鈣離子通道活性的調(diào)控；③采用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞PI3K/AKT、MAPK/ERK相關(guān)信號(hào)通路的活性，分析SDF-1/CXCR4可能激活的下游信號(hào)分子；④采用Westernblot和RT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF-C、MMP-2的表達(dá)，探討SDF-1/CXCR4與VEGF-C、MMP-2的相互作用關(guān)系。
　　研究結(jié)果：
　　(1)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：肺癌組織中CX

5、CR4的表達(dá)主要定位于胞膜和胞漿，呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性染色，其表達(dá)率為83.3％（50/60），而在正常肺和癌旁組織中則無(wú)表達(dá)；半定量RT-PCR檢測(cè)肺癌組織中CXCR4mRNA表達(dá)為83.3％(50/60)，與癌旁組織38.3％(23/60)、正常肺組織31.7％(19/60)差異顯著；免疫組化檢測(cè)肺鱗癌和腺癌中CXCR4的表達(dá)分別為79.3％(23/29)，87.1％(27/31)，鱗、腺癌間無(wú)顯著差異（p＞0.05）；在高分化癌中CXC

6、R4的表達(dá)為76.9％(10/13)，中分化癌中為82.1％(23/28)，低分化癌為84.2％(16/19)，雖然隨分化程度降低而呈增高趨勢(shì)，但三者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；TNM分期中Ⅰ期患者CXCR4的表達(dá)率為72.7％(8/11)，Ⅱ期患者為83.9％(26/31)，Ⅲ期患者為88.9％(16/18)，三期之間表達(dá)有顯著相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CXCR4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)具有：與癌細(xì)胞類(lèi)型無(wú)關(guān)，隨細(xì)胞分化程度降低而增強(qiáng)趨

7、勢(shì)，而與臨床TNM分期密切相關(guān)，分期越晚、表達(dá)越高的特征。表明CXCR4與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測(cè)CXCR4的表達(dá)有可能作為判斷轉(zhuǎn)移和預(yù)后的依據(jù)。
　　(2)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CXCR4-A549細(xì)胞系，Westernblot檢測(cè)表明，CXCR4-A549較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)明顯增高，說(shuō)明構(gòu)建的CXCR4-A549細(xì)胞可以上調(diào)CXCR4的表達(dá)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)CXCR4表達(dá)后，CXCR

8、4-A549細(xì)胞的侵襲能力平均升高了1.62倍(p<0.05)；在SDF-1的誘導(dǎo)作用下，CXCR4-A549細(xì)胞趨化作用較A549細(xì)胞更為明顯(p<0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CXCR4-A549與A549細(xì)胞接種的各6只裸鼠致瘤率均為100％，平均瘤重分別為：4.37±0.96g，3.24±1.16g，兩組差異顯著(p＜0.05)。CXCR4-A549組6只鼠肺內(nèi)均可見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移瘤形成，而A549組僅2只肺內(nèi)有瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)轉(zhuǎn)移瘤形成。表

9、明過(guò)表達(dá)CXCR4的A549細(xì)胞在SDF-1的趨化作用下，其侵襲、成瘤及轉(zhuǎn)移能力均有明顯增強(qiáng)。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：與A549細(xì)胞相比，CXCR4-A549細(xì)胞周期S期和G2期的比例升高，增殖指數(shù)(PI)升高9.72％，凋亡細(xì)胞比率減少3.60％。提示SDF-1/CXCR4可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但兩組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。鈣離子內(nèi)流實(shí)驗(yàn)中，用100ng/mlSDF-1誘導(dǎo)20s，CXCR4-A549和A5459細(xì)胞內(nèi)熒

10、光顯著增強(qiáng)，隨時(shí)間延后而迅速的下降，兩組間鈣離子濃度有明顯差異(p<0.05)，表明SDF-1的作用具有時(shí)間依賴性。Westernblot檢測(cè)顯示，在SDF-1作用30min時(shí)，ERK與AKT磷酸化明顯。提示SDF-1/CXCR4可以活化PI3K/ERK和MAPK/AKT，激活下游分子啟動(dòng)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在上調(diào)CXCR4表達(dá)的CXCR4-A549細(xì)胞中，VEGF-C和MMP-2在mRNA和蛋白水平均明顯增高，而給予SDF-1后，其

11、增高趨勢(shì)更為明顯(p＜0.05)。說(shuō)明SDF-1/CXCR4與VEGF-C、MMP-2在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用。
　　結(jié)論：
　?。?）通過(guò)免疫組化法檢測(cè)，揭示了CXCR4在非小細(xì)胞癌中表達(dá)的基本特征是：癌組織中高于癌旁和正常肺組織；其表達(dá)與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)，隨癌細(xì)胞分化程度降低而增高趨勢(shì)，但與臨床TNM分期密切相關(guān)，有望成為判斷NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)之一。
　?。?）成功構(gòu)建CXCR4穩(wěn)定表達(dá)的肺癌A549細(xì)胞

12、系，經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，可上調(diào)CXCR4的表達(dá)；在SDF-1作用下，其體外遷移和體內(nèi)成瘤、轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。說(shuō)明SDF-1/CXCR4在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
　?。?）SDF-1/CXCR4軸可通過(guò)激活肺癌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、MAPK/ERK與PI3K/AKT信號(hào)通路，啟動(dòng)肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMPs、VEGF在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用。
　　本研究較系統(tǒng)地分析了SDF-1/CXCR4與肺癌的