旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細胞氧化應激和新生內(nèi)膜形成的分子機制.pdf

1、當血管內(nèi)皮損傷時，局部募集的炎性細胞可產(chǎn)生大量的活性氧分子（ROS），而ROS又可作為刺激因素，進一步激活血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移、增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)分泌等一系列病理事件，導致血管內(nèi)膜發(fā)生肥厚和硬化等病變。因此，尋找新的有效藥物，抑制損傷誘導的血管氧化應激反應以及由此引發(fā)的心血管疾病己成為藥物研發(fā)的熱點之一。
　　 黃酮類化合物（flavonoids）是自然界中廣泛存在的一類酚類物質(zhì)，是藥用植物中的主要活性成分。流行

2、病學研究表明，F(xiàn)lavonoids具有抗炎、抗氧化、抗凝血等生理活性，適量攝取可以降低心血管疾病的發(fā)生概率。
　　 歐亞旋覆花（Inula britannica L.）是菊科（compositae）、旋覆花屬多年野生草本植物，性味咸、溫；入肺、腎經(jīng)。旋覆花總黃酮（TFE）是旋覆花中含量最多的一類活性成分，其含量約占旋覆花干重的10.9％，主要成分包括槲皮素、木犀草素、蘆丁、槲皮苷和異槲皮苷等。其在心血管系統(tǒng)中的抗氧化功效未見報道

3、。本研究觀察TFE對內(nèi)皮剝脫誘導的血管組織氧化應激和新生內(nèi)膜形成的干預效應，并在細胞和分子水平上探討其作用機制，旨在挖掘TFE在防治心血管疾病中的藥用價值。
　　 1.旋覆花總黃酮抑制損傷誘導的血管組織氧化應激和新生內(nèi)膜形成研究證實，ROS是內(nèi)皮損傷誘導的血管內(nèi)膜增生的一個重要誘發(fā)因素，具有抗氧化作用的藥物均具有較好的抗血管硬化的臨床療效。TFE具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗衰老、抗腫瘤、降血脂等多種生理活性。然而，TFE對

4、損傷誘導的血管氧化應激和內(nèi)膜增生的干預效應尚不清楚。本部分研究，以大鼠頸外動脈和腹主動脈球囊剝脫內(nèi)膜增生模型為對象，觀察TFE對損傷誘導的血管氧化應激和內(nèi)膜增生的抑制效應和相互關(guān)系。
　　 1.1球囊損傷誘導血管內(nèi)膜增生
　　 形態(tài)學分析顯示，球囊剝脫內(nèi)皮3天后，血管損傷局部有大量血小板聚集，第7天時內(nèi)膜出現(xiàn)增厚，14天時增生達到峰值，可見血管內(nèi)膜向腔內(nèi)凸起，細胞增多且排列紊亂，內(nèi)膜呈現(xiàn)彌散性增厚。形態(tài)測量學分析顯示，術(shù)

5、后第7天，I/M比值開始升高；14天時，I/M比值較對照組增加50倍左右。表明本實驗復制的球囊剝脫內(nèi)膜增生模型是成功的。
　　 1.2 TFE劑量依賴性抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生
　　 為了觀察TFE抗內(nèi)膜增生效應，將制備的TFE乳液于術(shù)前3天至術(shù)后14天以不同劑量（12.5，25，50 mg/kg/d）灌服大鼠。結(jié)果顯示，無論是頸總動脈還是腹主動脈，給予高劑量（50 mg/kg/d）TFE組的血管內(nèi)膜增生程度較模型

6、組明顯減輕；抑制效應與陽性對照藥物阿托伐他汀（ATO）相似，兩組動物的血管腔內(nèi)徑比模型組均明顯擴大，而中、低劑量TFE的抗內(nèi)膜增生效應不明顯。
　　 1.3 TFE抑制球囊損傷誘導的血管氧化應激
　　 提示該藥物可提高血管組織的抗氧化能力。
　　 1.4 TFE降低大鼠血管組織中超氧陰離子（O2-）的含量
　　 血管組織O2-的生成量變化與內(nèi)膜增生程度具有正相關(guān)關(guān)系。
　　 1.5 TFE上調(diào)血管

7、組織中SOD蛋白的表達
　　 Western blot分析和免疫組化染色結(jié)果顯示，從假手術(shù)組的血管組織中可檢測到較高水平的SOD蛋白；而球囊損傷14天后，血管中SOD含量明顯降低，約為對照組的60％左右；給予TFE干預后，血管中的SOD含量有所增加，接近對照組水平，尤其在新生內(nèi)膜的管腔側(cè)，可見大量的SOD陽性染色顆粒。
　　 1.6 TFE抑制球囊剝脫誘導的VSMC的表型轉(zhuǎn)化
　　 對分化型VSMC標志基因SM2

8、2α的Western blot分析顯示，球囊損傷不同時間后，SM22α表達量呈進行性下降，表明VSMC由分化型向去分化型轉(zhuǎn)化；給予TFE干預治療后，損傷誘導的SM22α表達活性降低受到明顯抑制，表明該藥物可抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化。
　　 2.旋覆花總黃酮體外抑制血管平滑肌細胞氧化應激
　　 在動物整體水平上證明TFE能夠抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生和氧化應激的基礎上，為進一步探討TFE調(diào)制血管氧化應激的作用機制，本部分以

9、H2O2為誘導劑，建立VSMC氧化應激模型，給與TFE干預，同時以槲皮素（TFE的主要成分之一）為對照，比較觀察兩種制劑對VSMC氧化應激的調(diào)制效應。
　　 2.1 H2O2對VSMC生長的影響
　　 MTT分析結(jié)果表明，低濃度的H2O2（100-400μmol/L）處理VSMC后，不影響細胞活力和生長速度，高濃度的H2O2（>800μmol/L）具有明顯的細胞毒性作用。本研究采用200μmol/L H2O2的終濃度用于

10、后續(xù)實驗。
　　 2.2不同劑量TFE和槲皮素對VSMC生長的影響
　　 結(jié)果表明，TFE對細胞增殖的直接抑制效應較弱。
　　 2.3 TFE抑制VSMC中O2-的生成
　　 DHE染色結(jié)果顯示，200μmol/L H2O2刺激VSMC24 h后，與對照組相比，細胞內(nèi)紅色熒光的亮度明顯增強，提示細胞內(nèi)O2-生成明顯增多。
　　 2.4 FFE抑制H2O2誘導的MDA生成
　　 表明TFE和

11、槲皮素均可抑制H2O2誘導的MDA的生成，二者具有相同的功效。
　　 2.5 FFE上調(diào)SOD活性
　　 表明TFE和槲皮素均可以部分逆轉(zhuǎn)H2O2導致的SOD活性降低。
　　 3.旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細胞p47phox表達和磷酸化
　　 p47phox的表達活性、磷酸化水平和膜轉(zhuǎn)位速率的變化，均可直接影響細胞ROS的生成。
　　 本研究部分在已經(jīng)確證TFE具有抑制血管ROS生成，加快O2-清

12、除的基礎上，以p47phox為切入點，對TFE減少ROS產(chǎn)生的上游機制進行了探討。
　　 3.1 H2O2誘導VSMC中p47Phox的表達
　　 結(jié)果提示，H2O2對p47phox表達的誘導效應具有濃度和時間依賴性。
　　 3.2 TFE抑制內(nèi)皮損傷誘導的血管p47phox的表達
　　 免疫組化結(jié)果顯示，球囊剝脫內(nèi)皮14天后的血管新生內(nèi)膜中，可見有大量p47phox陽性染色的VSMC，彌散性分布于新生內(nèi)

13、膜區(qū)：而給予TFE藥物的血管，其新生內(nèi)膜肥厚程度減輕的同時，p47phox陽性的細胞數(shù)也大大減少。Western blot分析得到了相似的結(jié)果，在球囊損傷3天時，p47Phox水平開始升高，約為對照組的1.9倍；到第14天時達到高峰，約為對照組的4倍左右；預先給予TFE藥物干預組，其損傷誘導的p47phox的表達上升被部分抑制，與14天的模型組相比降低50％以上。
　　 3.3 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導的VSMC中p47p

14、hox的表達
　　 為了在細胞水平上進一步驗證TFE對p47phox似表達的抑制效應，用TFE處理VSMC，以槲皮素作為陽性對照。表明TFE和槲皮素可抑制H2O2誘導的VSMC中p47phox的基因轉(zhuǎn)錄。
　　 3.4 FFE和槲皮素抑制H2O2誘導的p47phox的磷酸化
　　 免疫沉淀分析結(jié)果顯示，對照組VSMC中，p47phox的磷酸化水平相對較低，H2O2刺激VSMC15 min、30 min、1 h后，

15、p47phox磷酸化水平快速、短暫升高，于刺激15 min時即達高峰，隨后略有降低，但仍高于正常水平。
　　 4.旋覆花總黃酮對ERK1/2、AKT和NF-κB信號通道的調(diào)制作用
　　 血管內(nèi)皮損傷局部募集的炎性細胞除釋放多種致炎因子外，還可產(chǎn)生大量的ROS，后者可通過影響胞內(nèi)信號分子的磷酸化修飾，而誘導細胞產(chǎn)生氧化應激。細胞內(nèi)有多條信號通路參與介導ROS誘導的p47Phox磷酸化過程。
　　 4.1 FFE和槲

16、皮素抑制內(nèi)皮損傷和H2O2誘導的ERK1/2的磷酸化
　　 免疫組化和Western blot分析檢測了TFE和槲皮素對氧化應激誘導的ERK1/2磷酸化的影響，結(jié)果顯示，球囊剝脫損傷14天后，模型組大鼠血管新生內(nèi)膜VSMC中有大量磷酸化ERK1/2陽性染色顆粒；而給藥組大鼠新生內(nèi)膜肥厚程度減輕的同時，血管組織中磷酸化ERK1/2陽性顆粒數(shù)量明顯減少。
　　 4.2 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導的Akt的磷酸化
　

17、　 Western blot結(jié)果顯示，不同條件處理的VSMC，其總Akt表達量基本一致，但磷酸化Akt的水平存在明顯差異。
　　 4.3 TFE和槲皮素能夠抑制H2O2誘導的NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位
　　 結(jié)果表明，TFE和槲皮素可不同程度地抑制H2O2誘導的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，而槲皮素單體具有更強的抑制效應。
　　 結(jié)論:
　　 1.FFE通過上調(diào)總SOD蛋白表達和活性、促進O2-的清除

18、，降低球囊損傷誘導的血管氧化應激，進而抑制血管新生內(nèi)膜形成和由此導致的血管狹窄。
　　 2.TFE可以部分逆轉(zhuǎn)H2O2導致的SOD活性降低、降低MDA水平、促進O2-的清除，從而抑制VSMC氧化應激。
　　 3.TFE可抑制p47phox基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達及磷酸化活化，該效應是TFE減少ROS生成和抑制氧化應激的分子機制之一。
　　 4.TFE對ROS誘導的ERK1/2、Akt和NF-κB信號通路的激活具有不同