雷帕霉素聯(lián)用阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷大鼠血管平滑肌細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的疾病，也是冠心病的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)膜的灶狀纖維化，粥樣斑塊形成，致管壁變硬、管腔狹窄，并引起一系列繼發(fā)性病變。血管平滑肌細(xì)胞作為血管壁的重要組成部分，在動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)病理變化中都起了作用。氧化應(yīng)激損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成的一個(gè)重要機(jī)制。而血管平滑肌細(xì)胞在氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下的病理性增殖等一系列繼發(fā)改變，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中起了重要作用，亦是形成支架內(nèi)再狹窄的重要原因。因

2、此抗炎抗氧化和抑制平滑肌細(xì)胞增殖是實(shí)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化及抑制支架內(nèi)再狹窄的重要途徑。
　　 阿托伐他汀作為治療動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)藥物他汀類中的一種，現(xiàn)已有多項(xiàng)研究證實(shí)阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。以上這些作用也是阿托伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要機(jī)制之一。雷帕霉素做為一種免疫抑制劑，通過(guò)與相應(yīng)免疫嗜素RMBP結(jié)合抑制細(xì)胞周期G0期和G1期，阻斷G1進(jìn)入S期而發(fā)揮作用，現(xiàn)普遍應(yīng)用于藥物洗脫支架中，以達(dá)到減少血

3、管壁對(duì)損傷修復(fù)過(guò)程中血管平滑肌細(xì)胞及新生內(nèi)膜的過(guò)度增生造成的再狹窄。另有文獻(xiàn)指出，雷帕霉素抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)可能造成血管平滑肌細(xì)胞的失功能性，但目前對(duì)于該方面的研究較少，且存在著較多爭(zhēng)議，特別是對(duì)氧化應(yīng)激損傷血管平滑肌細(xì)胞的影響研究甚少。此外，雷帕霉素聯(lián)用阿托伐他汀對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖等的影響仍缺少文獻(xiàn)支持。因此，本實(shí)驗(yàn)以氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下的大鼠血管平滑肌細(xì)胞作為模型，通過(guò)應(yīng)用阿托伐他汀以及不同劑量的雷帕霉素干預(yù)氧化應(yīng)激損傷狀

4、態(tài)下的大鼠血管平滑肌細(xì)胞，并運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討兩種藥物對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠平滑肌細(xì)胞的影響。
　　 目的：
　　 以大鼠主動(dòng)脈分離后原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，在三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)下使其處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如水溶性四唑鹽(WST)-1法、水溶性四唑鹽(WST)-8法、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase C

5、hain Reaction，RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等，觀察阿托伐他汀以及不同劑量的雷帕霉素對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠平滑肌細(xì)胞的增殖、氧化損傷等的影響。旨在為兩種藥物在臨床對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療，以及對(duì)支架植入術(shù)后支架再狹窄的影響提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 取雄性wistar大鼠，體重180-200 g，斷頭處死，無(wú)菌條件下取主動(dòng)脈并剝?nèi)ネ饽ず蛢?nèi)膜，應(yīng)用組織貼塊法進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈平滑肌

6、細(xì)胞原代培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SM-actin）抗體免疫組織化學(xué)鑒定，實(shí)驗(yàn)取用4-6代細(xì)胞。
　　 細(xì)胞毒性檢測(cè)：
　　 實(shí)驗(yàn)分組:1）正常對(duì)照組2）t-BHP(40μmol/L組)3) t-BHP(60μmol/L組)4) t-BHP(80μmol/L組)5）t-BHP(100μmol/L組)6）t-BHP(200μmol/L組);放入孵育箱分別干預(yù)12h、24

7、h、48h、72h，采用CCK8試劑盒，應(yīng)用水溶性四唑鹽(WST)-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，目的是摸索t-BHP誘導(dǎo)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的濃度及時(shí)間。最后確定干預(yù)濃度為60μmol/L，24小時(shí)。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖率的影響:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀（3μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100

8、組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，采用CCK8試劑盒，應(yīng)用水溶性四唑鹽(WST)-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。
　　 雷帕毒素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影響:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀(3μmol/L)組（A3組）、雷帕霉素50nm

9、ol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，采用水溶性四唑鹽(WST)-1法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD活力水平。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平的影響:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他?。?μm

10、ol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組(R100組)、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，采用硫代巴比妥酸法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA水平。
　　 細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖糖苷酶(SA-β-Gal)染色:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀(3μmol/L

11、)組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，采用由碧云天公司細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒，顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)藍(lán)染的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每次隨機(jī)挑選500個(gè)細(xì)胞，得到陽(yáng)性細(xì)胞百分率，為衰老細(xì)胞的百分率。
　　

12、 雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮型NO合成酶(eNOS) mRNA表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他?。?μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，總RNA采

13、用Trizol試劑盒提取，實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)量。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮型NO合成酶(eNOS)蛋白表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀（3μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol

14、/L）。實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時(shí)后，加入三丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時(shí)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取適當(dāng)量蛋白，利用Western blot蛋白免疫印跡法測(cè)定血管平滑肌細(xì)胞中一氧化氮合成酶(eNOS)蛋白的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖率的影響:統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞增殖率（96.68±1.85％）相

15、比，其余五組細(xì)胞增殖率均明顯下降（P均小于0.01）。與DMSO組（76.97±5.48％）相比，四個(gè)藥物干預(yù)組增殖率也明顯下降，增殖率分別為單純阿托伐他汀(A3)組（64.99±3.82％）、小劑量雷帕霉素(R50)組（62.27±7.10％）、大劑量雷帕霉素(R100)組（54.34±9.09％）和聯(lián)合用藥(R100+A3)組（38.09±6.07％），P均小于0.01。單純阿托伐他汀和小劑量雷帕霉素組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而大劑量

16、雷帕霉素組細(xì)胞增殖率低于A3組(P=0.005)和小劑量R50組（P=0.030）。聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖率較以上所有組均明顯下降(P=0.000)。
　　 2、雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影響:6組細(xì)胞的SOD活力水平分別為:93.88±5.79(U/mgprot),92.08±12.05(U/mgprot),107.56±8.88(U/mgprot),109.91±

17、13.31(U/mgprot),125.17±12.48(U/mgprot),140.53±8.42(U/mgprot)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞相比較，DMSO組細(xì)胞SOD活力水平無(wú)明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細(xì)胞SOD活力水平明顯高于空白組和DMSO組（P均小于0.05）。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間細(xì)胞SOD活力水平無(wú)明顯差異。大劑量雷帕霉素組細(xì)胞SOD活力水平明顯高于A3組（P=0.007）和小劑量R50組（P=0

18、.013）。聯(lián)合用藥組細(xì)胞SOD活力則明顯高于以上所有組（P＜0.05）。
　　 3、雷帕霉素及阿托伐他汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平的影響:6組細(xì)胞的MDA水平分別為:2.26±0.32(nmol/mgprot)，2.04±0.19(nmol/mgprot),1.41±0.33(nmol/mgprot),1.35±0.35(nmol/mgprot),0.99±0.25（nmol/mgprot），0

19、.62±0.21(nmol/mgprot)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞相比較，DMSO組細(xì)胞的MDA水平無(wú)明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細(xì)胞MDA水平與空白組和DMSO組相比則明顯降低(P均小于0.05)。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間細(xì)胞MDA水平無(wú)明顯差異。大劑量雷帕霉素組其細(xì)胞MDA水平明顯低于A3組和小劑量R50組(P均小于0.05)。聯(lián)合用藥組細(xì)胞MDA水平較以上所有組均明顯降低(P＜0.05）。
　　 4、各

20、組細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖糖苷酶(SA-β-Gal)染色陽(yáng)性率的比較
　　 6組細(xì)胞SA-β-Gal染色陽(yáng)性率分別為:28.93±2.39％，26.11±3.15％，13.05±1.68％，12.29±1.28％，4.98±1.09％，2.38±0.83％。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞相比較，DMSO組SA-β-Gal染色率無(wú)明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細(xì)胞SA-β-Gal染色率與空白組和DMSO組相比則明顯降低(P均小于0.05

21、)。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間染色率無(wú)明顯差異。大劑量雷帕霉素組細(xì)胞SA-β-Gal染色率明顯則低于A3組和小劑量R50組(P均小于0.05)。聯(lián)合用藥組細(xì)胞SA-β-Gal染色率較以上所有組均明顯降低。
　　 5、實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 通過(guò)多次采用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eNOS無(wú)論基因水平還是蛋白水平在Wist

22、ar大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞上均無(wú)表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1)阿托伐他汀及雷帕霉素均能抑制氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖，兩藥聯(lián)用的抑制作用大于兩種藥物單獨(dú)應(yīng)用。
　　 2)阿托伐他汀及雷帕霉素均能提高氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞的SOD活力水平，兩藥聯(lián)用優(yōu)于兩藥單獨(dú)應(yīng)用。
　　 3)阿托伐他汀及雷帕霉素均能降低氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細(xì)胞的MDA水平，兩藥聯(lián)用優(yōu)于兩藥單獨(dú)