Tγδ1和Tγδ17細胞在結核分枝桿菌感染中的免疫作用.pdf

1、研究背景：全球目前有近三分之一的人口感染了結核分枝桿菌（Mtb)，其中5~10％可發(fā)展為結核?。═B)，而且 TB仍是近年來世界上因感染單一病原體而死亡的最重要病因之一。如何快速診斷出結核病是治療結核、控制結核的重點項目之一。檢測結核桿菌感染的試劑盒（T-SPOT-TB)根據免疫應答及回憶反應的原理，用 ESAT6/CFP10刺激 CD4+T細胞產生 IFN-γ，但這種試劑盒不能區(qū)分Mtb隱匿性感染者(以下簡稱隱感者)與 TB患者。近年

2、已證實了γδT細胞在結核感染中的免疫作用。γδT細胞對 Mtb抗原的刺激有增殖反應并產生 IFN-γ。與正常人（HD)或隱感者相比，TB患者γδT細胞對 Mtb抗原刺激后的增殖反應降低，而γδT細胞產生 IFN-γ（Tγδ1細胞)的能力有何不同尚不清楚。已報道不同細胞因子可誘導小鼠γδT細胞產生 IL-17（Tγδ17細胞)。但誘導人γδT細胞產生 IL-17的調控機制以及 Mtb抗原的影響，也還有待探討。
　　目的：檢測 HD，

3、TB患者經分離外周血單個核細胞（PBMC）培養(yǎng)增殖后用Mtb-HAg刺激后 T細胞亞群產生 IFN-γ和 IL-17的變化。觀察不同細胞因子和Mtb抗原在誘導γδT細胞產生 IL-17中的作用。以闡明隱感者和 TB患者之間γδT細胞的天然和特異性免疫的差異，以及為 TB患者不同病程期間的免疫功能狀態(tài)提供新的判定指標。
　　方法：1.流式細胞術檢測 Mtb-Ag刺激γδT細胞產生IFN-γ
　　1.1采集3例 HD外周血，加入

4、 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)10h，14h，18h后，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色，流式細胞儀檢測產生 IFN-γ的T細胞亞群比例。
　　1.2采集隱感者和 TB患者外周血，分別用磷酸化抗原 HDMAPP、Mtb-HAg和 Mtb-HAg(10K)刺激培養(yǎng)14h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色，流式細

5、胞儀檢測產生IFN-γ的T細胞亞群比例。
　　1.3收集 HD和 TB患者外周血分離 PBMC經培養(yǎng)增殖12天后的細胞，用或不用 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)2 h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色，流式細胞儀檢測γδT細胞中產生 IFN-γ和 IL-17細胞的相對比例。
　　2. ELISPOT方法檢測隱感者和 TB外周血 T細胞亞群產生 IFN-γ和IL-17<

6、br>　　2.1運用結核桿菌感染 T細胞酶聯免疫斑點診斷試劑盒從 HD人群中篩選隱感者，采集HD外周血分離 PBMC調整細胞數，按實驗設計每孔加入細胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20 h后，進行洗滌孵育顯色，最后進行斑點計數統(tǒng)計，每10萬個細胞中產生 IFN-γ細胞數。
　　2.2采集隱感者和TB患者外周血分離 PBMC，取一部分細胞進行免疫磁珠的分選收集無γδT細胞（γδˉ）的PBMC，再將這兩部分細胞調整細胞數按實驗

7、設計每孔加入細胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20h后，進行洗滌孵育顯色，最后進行斑點計數統(tǒng)計，每10萬個細胞中產生IFN-γ和IL-17細胞數。
　　3. Mtb-Ag和細胞因子(CK)對γδT細胞激活誘導產生IL-17和IL-17﹢IL-22﹢
　　采集 HD外周血分離 PBMC，加入 Mtb-HAg、HDMAPP、Mtb-SoAg和細胞因子（IL-1β、TGF-β）培養(yǎng)3天后，加入 rIL-2刺激培養(yǎng)，第9天加

8、入 IL-23繼續(xù)培養(yǎng)至12天，使其成為富含效應性γδT細胞的細胞群，收集細胞用PMA/Ionomycin和 Monensin刺激培養(yǎng)6h，流式細胞儀檢測產生 IL-17和 IL-17+IL-22+的γδT細胞亞群比例。
　　結果：1. Mtb-HAg刺激 HD外周血（n＝3）第16 h開始，γδT細胞中產生IFN-γ的細胞逐漸增多，至20 h時和24 h時，分別為3.33%和3.50%。
　　2、用 Mtb感染 T細胞診斷

9、 ELISPOT試劑盒檢測從 HD人群中篩選隱感者，利用判定陽性標準從17例 HD人群中篩選出11例隱感者。
　　3、隱感者經不同抗原刺激20h后用流式細胞術檢測發(fā)現，αβT細胞和γδT細胞均能產生 IFN-γ，而產生 IFN–γ的γδT細胞比αβT細胞多。αβT細胞和γδT細胞中 IFN-γ+細胞比率在 HDMAPP刺激組（n＝6）（0.45%和7.42%），Mtb-HAg刺激組（n＝11）（0.42％和5.63％），Mtb-H

10、Ag(10K)組（n＝8）（0.61％和7.6％）中比較，均有明顯差異（p<0.05）。 TB患者經不同抗原刺激20h后，γδT細胞中產生 IFN-γ細胞也比αβT細胞中的多。在 HDMAPP刺激組（n＝6）（2.0%，3.35%）， Mtb-HAg刺激組（n＝12）（0.87％和2.11％），Mtb-HAg(10K)組（n＝10）（0.64％和2.35％）。各實驗組中αβT細胞和γδT細胞中 IFN-γ+細胞比率的比較均有明顯差異（p

11、<0.05）。進一步分析發(fā)現， Mtb-HAg刺激后 TB患者γδT細胞中 IFN-γ產生細胞的比例顯著低于隱感者。
　　4、運用 ELISPOT方法檢測隱感者（n＝11）和 TB（n＝11）患者 IFN-γ和 IL-17兩種細胞因子，隱感者和 TB患者比較，經 PHA刺激， IFN-γ和IL-17兩種細胞因子， TB患者比隱感者產生的要少，兩者有明顯差異 p<0.05。
　　5、HD和 TB患者經 PBMC培養(yǎng)增殖12天，

12、用 Mtb-HAg再刺激用流式細胞術檢測γδT細胞 IFN-γ+細胞比率。 HD和 TB患者用或不用 Mtb-HAg再刺激檢測 IFN-γ比較有差異顯著性 p<0.05。
　　6、不同抗原刺激和極化培養(yǎng) Tγδ17細胞的比較，Mtb-HAg+CK組比Mtb-HAg組明顯升高，兩組有明顯差異（p<0.05），HDMAPP+CK組比HDMAPP組明顯升高，兩組有明顯差異（p<0.05）， Mtb-SoAg和Mtb-SoAg+CK組則無

13、差異性。
　　結論：1. Mtb-HAg刺激 HD外周血γδT細胞產生 IFN-γ的最適時間是20h。
　　2.流式細胞術檢測結果表明， Mtb-HAg刺激后隱感者和 TB患者的外周γδT細胞中產生 IFN-γ的細胞均顯著高于αβT細胞。
　　3.流式細胞術和 ELISPOT檢測均表明，隱感者γδT細胞中產生 IFN-γ細胞均比 TB患者的高。
　　4.免疫磁珠負選法和 ELISPOT檢測初步表明隱感者γδT細胞

14、中產生IL-17細胞比 TB患者的高。
　　5. HD和 TB患者經 PBMC培養(yǎng)增殖后，經 Mtb-HAg刺激后γδT細胞中產生 IFN-γ的細胞明顯增多，而產生 IL-17細胞經刺激后是下降的。
　　6. HD外周血分離 PBMC， Mtb-HAg、磷酸抗原（HDMAPP）激活γδT細胞同時加入含誘導性細胞因子（IL-1β，TGF-β，IL-23），可誘導 Tγδ17細胞的分化和增殖，而 Mtb-SoAg則不能有效的誘導