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文檔簡介
1、研究背景:全球目前有近三分之一的人口感染了結核分枝桿菌(Mtb),其中5~10%可發(fā)展為結核?。═B),而且 TB仍是近年來世界上因感染單一病原體而死亡的最重要病因之一。如何快速診斷出結核病是治療結核、控制結核的重點項目之一。檢測結核桿菌感染的試劑盒(T-SPOT-TB)根據免疫應答及回憶反應的原理,用 ESAT6/CFP10刺激 CD4+T細胞產生 IFN-γ,但這種試劑盒不能區(qū)分Mtb隱匿性感染者(以下簡稱隱感者)與 TB患者。近年
2、已證實了γδT細胞在結核感染中的免疫作用。γδT細胞對 Mtb抗原的刺激有增殖反應并產生 IFN-γ。與正常人(HD)或隱感者相比,TB患者γδT細胞對 Mtb抗原刺激后的增殖反應降低,而γδT細胞產生 IFN-γ(Tγδ1細胞)的能力有何不同尚不清楚。已報道不同細胞因子可誘導小鼠γδT細胞產生 IL-17(Tγδ17細胞)。但誘導人γδT細胞產生 IL-17的調控機制以及 Mtb抗原的影響,也還有待探討。
目的:檢測 HD,
3、TB患者經分離外周血單個核細胞(PBMC)培養(yǎng)增殖后用Mtb-HAg刺激后 T細胞亞群產生 IFN-γ和 IL-17的變化。觀察不同細胞因子和Mtb抗原在誘導γδT細胞產生 IL-17中的作用。以闡明隱感者和 TB患者之間γδT細胞的天然和特異性免疫的差異,以及為 TB患者不同病程期間的免疫功能狀態(tài)提供新的判定指標。
方法:1.流式細胞術檢測 Mtb-Ag刺激γδT細胞產生IFN-γ
1.1采集3例 HD外周血,加入
4、 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)10h,14h,18h后,再加入莫能霉素(Monensin)繼續(xù)培養(yǎng)6h,收集細胞,加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色,流式細胞儀檢測產生 IFN-γ的T細胞亞群比例。
1.2采集隱感者和 TB患者外周血,分別用磷酸化抗原 HDMAPP、Mtb-HAg和 Mtb-HAg(10K)刺激培養(yǎng)14h,再加入莫能霉素(Monensin)繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集細胞,加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色,流式細
5、胞儀檢測產生IFN-γ的T細胞亞群比例。
1.3收集 HD和 TB患者外周血分離 PBMC經培養(yǎng)增殖12天后的細胞,用或不用 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)2 h,再加入莫能霉素(Monensin)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,收集細胞,加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內染色,流式細胞儀檢測γδT細胞中產生 IFN-γ和 IL-17細胞的相對比例。
2. ELISPOT方法檢測隱感者和 TB外周血 T細胞亞群產生 IFN-γ和IL-17<
6、br> 2.1運用結核桿菌感染 T細胞酶聯免疫斑點診斷試劑盒從 HD人群中篩選隱感者,采集HD外周血分離 PBMC調整細胞數,按實驗設計每孔加入細胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20 h后,進行洗滌孵育顯色,最后進行斑點計數統(tǒng)計,每10萬個細胞中產生 IFN-γ細胞數。
2.2采集隱感者和TB患者外周血分離 PBMC,取一部分細胞進行免疫磁珠的分選收集無γδT細胞(γδˉ)的PBMC,再將這兩部分細胞調整細胞數按實驗
7、設計每孔加入細胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20h后,進行洗滌孵育顯色,最后進行斑點計數統(tǒng)計,每10萬個細胞中產生IFN-γ和IL-17細胞數。
3. Mtb-Ag和細胞因子(CK)對γδT細胞激活誘導產生IL-17和IL-17﹢IL-22﹢
采集 HD外周血分離 PBMC,加入 Mtb-HAg、HDMAPP、Mtb-SoAg和細胞因子(IL-1β、TGF-β)培養(yǎng)3天后,加入 rIL-2刺激培養(yǎng),第9天加
8、入 IL-23繼續(xù)培養(yǎng)至12天,使其成為富含效應性γδT細胞的細胞群,收集細胞用PMA/Ionomycin和 Monensin刺激培養(yǎng)6h,流式細胞儀檢測產生 IL-17和 IL-17+IL-22+的γδT細胞亞群比例。
結果:1. Mtb-HAg刺激 HD外周血(n=3)第16 h開始,γδT細胞中產生IFN-γ的細胞逐漸增多,至20 h時和24 h時,分別為3.33%和3.50%。
2、用 Mtb感染 T細胞診斷
9、 ELISPOT試劑盒檢測從 HD人群中篩選隱感者,利用判定陽性標準從17例 HD人群中篩選出11例隱感者。
3、隱感者經不同抗原刺激20h后用流式細胞術檢測發(fā)現,αβT細胞和γδT細胞均能產生 IFN-γ,而產生 IFN–γ的γδT細胞比αβT細胞多。αβT細胞和γδT細胞中 IFN-γ+細胞比率在 HDMAPP刺激組(n=6)(0.45%和7.42%),Mtb-HAg刺激組(n=11)(0.42%和5.63%),Mtb-H
10、Ag(10K)組(n=8)(0.61%和7.6%)中比較,均有明顯差異(p<0.05)。 TB患者經不同抗原刺激20h后,γδT細胞中產生 IFN-γ細胞也比αβT細胞中的多。在 HDMAPP刺激組(n=6)(2.0%,3.35%), Mtb-HAg刺激組(n=12)(0.87%和2.11%),Mtb-HAg(10K)組(n=10)(0.64%和2.35%)。各實驗組中αβT細胞和γδT細胞中 IFN-γ+細胞比率的比較均有明顯差異(p
11、<0.05)。進一步分析發(fā)現, Mtb-HAg刺激后 TB患者γδT細胞中 IFN-γ產生細胞的比例顯著低于隱感者。
4、運用 ELISPOT方法檢測隱感者(n=11)和 TB(n=11)患者 IFN-γ和 IL-17兩種細胞因子,隱感者和 TB患者比較,經 PHA刺激, IFN-γ和IL-17兩種細胞因子, TB患者比隱感者產生的要少,兩者有明顯差異 p<0.05。
5、HD和 TB患者經 PBMC培養(yǎng)增殖12天,
12、用 Mtb-HAg再刺激用流式細胞術檢測γδT細胞 IFN-γ+細胞比率。 HD和 TB患者用或不用 Mtb-HAg再刺激檢測 IFN-γ比較有差異顯著性 p<0.05。
6、不同抗原刺激和極化培養(yǎng) Tγδ17細胞的比較,Mtb-HAg+CK組比Mtb-HAg組明顯升高,兩組有明顯差異(p<0.05),HDMAPP+CK組比HDMAPP組明顯升高,兩組有明顯差異(p<0.05), Mtb-SoAg和Mtb-SoAg+CK組則無
13、差異性。
結論:1. Mtb-HAg刺激 HD外周血γδT細胞產生 IFN-γ的最適時間是20h。
2.流式細胞術檢測結果表明, Mtb-HAg刺激后隱感者和 TB患者的外周γδT細胞中產生 IFN-γ的細胞均顯著高于αβT細胞。
3.流式細胞術和 ELISPOT檢測均表明,隱感者γδT細胞中產生 IFN-γ細胞均比 TB患者的高。
4.免疫磁珠負選法和 ELISPOT檢測初步表明隱感者γδT細胞
14、中產生IL-17細胞比 TB患者的高。
5. HD和 TB患者經 PBMC培養(yǎng)增殖后,經 Mtb-HAg刺激后γδT細胞中產生 IFN-γ的細胞明顯增多,而產生 IL-17細胞經刺激后是下降的。
6. HD外周血分離 PBMC, Mtb-HAg、磷酸抗原(HDMAPP)激活γδT細胞同時加入含誘導性細胞因子(IL-1β,TGF-β,IL-23),可誘導 Tγδ17細胞的分化和增殖,而 Mtb-SoAg則不能有效的誘導
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