結核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結核病患者免疫分子標識的篩選.pdf

1、WHO報道目前全球已有1/3的人口感染了可導致結核病(tuberculosis，TB)的病原菌-結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)。M.tb感染人體后一般會引起三種免疫結果：大約5％的感染者可在體內完全清除細菌、5～10%的感染者發(fā)展成臨床結核病患者、90%感染者可長期攜帶病原菌成為潛伏感染者。所以結核分枝桿菌引起的感染人群是一個復雜群體。在結核分枝桿菌與宿主的相互作用中，細胞免疫應答的結果直

2、接影響到疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸。因此，本論文重點研究和篩選與宿主細胞免疫功能密切相關的基因，力爭為最終篩選一組除了IFN-γ以外的、可以體現(xiàn)機體不同感染狀態(tài)和不同病情的免疫標識提供基礎研究數(shù)據(jù)。
　　 論文第一部分結核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結核病患者免疫分子標識的篩選和驗證
　　 因為潛伏感染人群是一個復雜的人群，因此本論文在臨床樣本分組方面結合結核菌素實驗(TST)和體外M.tb抗原特異性的IFN-γ釋放水平實驗(E

3、LISPOT)將結核分枝桿菌潛伏感染者細化為低IFN-γ釋放水平的潛伏感染者1組(LTB1)和高IFN-γ釋放水平的潛伏感染者2組(LTB2)。其次，選擇化療前的初發(fā)結核病患者作為病人組(TB)。CD4+T細胞介導的免疫反應在結核病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用勿庸置疑，因此，本部分重點通過研究四組人群（HD、LTB1、LTB2和TB）外周血CD4+T細胞全基因組表達譜。通過生物信息學分析，我們在本論文中選擇對TNFSFs/TNFRSFs超家族

4、成員在四組不同人群中的表達情況進行了系統(tǒng)而全面的研究。熒光定量PCR和ELISA等驗證實驗結果表明：
　　 1．對人類外周血CD4+T細胞全基因組表達譜進行分析結果顯示：低IFN-γ釋放水平的潛伏感染組1人群( LTB1)外周血CD4+T細胞全基因組表達譜與同樣為潛伏感染者但是高表達IFN-γ的潛伏感染組2(LTB2)相差較遠；而低IFN-γ釋放水平的潛伏感染者(LTB1)全基因組表達譜更接近于TST陰性的健康對照。
　　

5、 2．TNFSFs/TNFRSFs超家族成員TNFSF13(APRIL)、TNFSF13B(BAFF)的結果顯示BAFF/APRIL通路可能參與結核病發(fā)生的免疫機制，兩者RNA和蛋白表達水平在結核病患者CD4+T細胞內均顯著升高。而且，二者游離的蛋白水平在結核性胸膜炎患者胸水尤其升高。因此，TNFSF13(APRIL)、TNFSF13B(BAFF)可能具有預測和評估結核病病情發(fā)展的價值。
　　 論文第二部分結核分枝桿菌潛伏感染

6、者和初發(fā)結核病患者T細胞分化相關基因的初步研究以及體液中免疫因子的高通量檢測
　　 CD4+T細胞是復雜的，在同一時間可以存在不同發(fā)育階段或功能的亞群，行使不同的功能。因此在論文第二部分，我們同樣利用熒光定量PCR方法檢測了與T細胞分化及其功能相關的基因，希望能夠初步了解其相關基因是否與結核病的發(fā)生有關。初步結果表明：結核病的發(fā)生發(fā)展不僅僅只與Th1和Th2的分化相關，如其他文獻所示，Th17、調節(jié)性T細胞等細胞亞群同樣可能發(fā)揮

7、重要作用。而且，通過細胞內基因表達水平比較也看出：
　　 1．Th17相關基因，RORc在LTB1和TB組明顯下調。Th17的形成需要IL-6R受體信號，IL6ST/gp130基因表達的蛋白是IL-6R信號通路上的一個分子，我們的驗證結果也發(fā)現(xiàn)，IL6ST/gp130在LTB1組表達明顯下調。
　　 2．FOXP3是調節(jié)性T細胞的標識分子之一、FOXP3在LTB2和TB組明顯下調；S1PR1對調節(jié)性T細胞的生成有抑制作用

8、，我們發(fā)現(xiàn)SIPR1在LTB1、LTB2和TB中都明顯下調。
　　 同時，我們也利用高通量的液態(tài)芯片技術，檢測不同感染狀態(tài)（潛伏患者1組和2組）和不同病情（初發(fā)結核病人和結核性胸膜炎）患者外周血和胸水中常見的23個細胞因子和趨化因子，尋找易于檢測的、具有預測和評估疾病發(fā)生、發(fā)展價值的免疫分子。通過比較初發(fā)結核病患者外周血和結核性胸膜炎患者胸水中的所檢測因子的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)了以下結果：
　　 1．包括IFN-γ、IL-

9、1Rα、IL-6、G-CSF等炎性因子和趨化因子均在結核性胸膜炎患者胸水中顯著性高表達。
　　 2．因為文獻報道也證明IFN-γ、G-CSF等因子可以刺激多種細胞產(chǎn)生TNFSF13(APRIL)和TNFSF13B(BAFF)，為本論文第一部分結果中BAFF/APRIL在結核性胸膜炎患者胸水中高表達提供了可能的機制。
　　 綜上所述：本論文通過對不同感染狀態(tài)的潛伏期患者和初發(fā)結核病人T細胞功能基因的研究，首次提出TNFSF