CD40 shRNA干擾CD40-CD40L在阻斷共刺激通路作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討CD40shRNA對DC表面抗原CD40表達(dá)的影響及shRNA干擾后DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞無能的機(jī)制。 方法:采用培養(yǎng)基選擇方法體外培養(yǎng)小鼠骨髓源DC；經(jīng)體外合成針對CD40mRNA序列特異性CD40shRNA，并構(gòu)建于質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染DC；熒光實(shí)時(shí)定量PCR、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后CD40mRNA表達(dá)水平以及細(xì)胞表面抗原CD40、MHCⅡ、CD11c表達(dá)情況；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)觀察shRNA干擾對DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的

2、影響，并以熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)體系中IL-12mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果:經(jīng)體外培養(yǎng)，每只小鼠可獲1.5-2×107骨髓源DC；shRNA轉(zhuǎn)染DC后，CD40mRNA表達(dá)水平明顯減低，細(xì)胞表面抗原CD40陽性率由49.2％下降至16.9％，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測CD40mRNA抑制率49.7％；MHCⅡ、CD11c陽性率無明顯變化；混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，shRNA干擾后DC對T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)明顯下降(P

3、＜0.01)，且反應(yīng)體系中IL-12mRNA表達(dá)水平抑制率為44.9％。 結(jié)論:培養(yǎng)基選擇法可收獲大量骨髓源DC，具有典型的形態(tài)、高表達(dá)MHCⅡ和共刺激分子；所獲骨髓源DC能激活初始型T細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答。以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染針對CD40mRNA的shRNA質(zhì)粒載體，效果可更持久并特異地抑制CD40表達(dá)。經(jīng)RNAi敲減后DC激活異系淋巴細(xì)胞的能力降低，合成、分泌IL-12能力下降，并誘使Th細(xì)胞分化方向發(fā)生免疫