低氧預(yù)處理增強骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對心肌細(xì)胞凋亡的保護作用.pdf

1、目的:體外模擬心肌細(xì)胞缺血微環(huán)境,探索經(jīng)過低氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)對持續(xù)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及可能的機制。
　　方法:①實驗動物及細(xì)胞:健康SPF級,雄性Sprague-Dawley大鼠若干只,實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn);大鼠心肌細(xì)胞株:H9c2(2-1),購自博士德公司,貨號:CX0125。②MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:采用

2、貼壁法結(jié)合消化控制法體外培養(yǎng)骨髓MSCs,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達。③MSCs條件培養(yǎng)液的制備:取第四代MSCs細(xì)胞,接種貼壁后,加上不含血清的低糖 Dulbecco's modified Engle's medium(DMEM)培養(yǎng)液,分別于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集培養(yǎng)液離心后取上清,分別為 MSCs條件培養(yǎng)液和 MSCs低氧條件培養(yǎng)液,-20℃保存。④實驗方案:心肌細(xì)胞分為4組

3、:心肌細(xì)胞置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(正常組),心肌細(xì)胞置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(單純?nèi)毖踅M),心肌細(xì)胞加上MSCs條件培養(yǎng)液后于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(MSCs組),心肌細(xì)胞加上MSCs低氧條件培養(yǎng)液后于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(MSCs低氧組)。⑤指標(biāo)檢測:MTT檢測各組細(xì)胞活力變化,Annexin V-FITC雙染標(biāo)記心肌細(xì)胞凋亡,免疫組化檢測各組Bax和Bcl-2蛋白的表達。
　　結(jié)果:①原代細(xì)胞接

4、種24h后可見少量貼壁細(xì)胞,首次換夜后可見散的貼壁細(xì)胞,呈短梭形、橢圓形、三角形等形態(tài);換夜傳代后,細(xì)胞形態(tài)趨于一致,呈長梭形,細(xì)胞呈集落式生長,集落外觀呈"漩渦"狀。②流式細(xì)胞儀檢測第4代MSCs表面標(biāo)記,CD31,CD45表達陰性,CD44,CD54表達陽性,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點。③細(xì)胞活力的檢測結(jié)果顯示:與正常組相比,其他三組的細(xì)胞活力均降低(P＜0.05),而與單純?nèi)毖踅M和MSCs組相比,MSCs低氧組的細(xì)胞活力較高(P＜

5、0.05)。④與正常組相比,單純?nèi)毖踅M心肌細(xì)胞凋亡率顯著增大(P＜0.05);與單純?nèi)毖踅M相比,MSCs組和 MSCs低氧組凋亡率均降低(P＜0.05);而與 MSCs組相比,MSCs低氧組凋亡率較低(P＜0.05)。⑤免疫組化光密度結(jié)果顯示:與單純?nèi)毖踅M和 MSCs組相比,MSCs低氧組 Bcl-2表達上調(diào),Bax表達顯著下調(diào),Bcl-2/Bax比值增大(P＜0.05)。
　　結(jié)論:MSCs對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的保護作用