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1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文表達(dá)HPV16E7可移植小鼠腫瘤細(xì)胞系的初步建立姓名:謝樹(shù)奪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師:王林波2002.5.1塹姿盔堂匿堂墮——————————絲生蘭墮絲羔——一提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)。/方法:\1重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建沒(méi)計(jì)分別含EcoRI和&D廳V限制性酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物,通過(guò)PCR反應(yīng)產(chǎn)生HPVl6E7基因。然后回收純化PCR產(chǎn)物,亞克隆到pGEM—T克隆載體。提取亞克隆質(zhì)粒酶切鑒定后,雙酶切并回收純
2、化切下的HPVl6E7基因。最后,回收產(chǎn)物連接真核表達(dá)載體pcDNA31(),酶切并測(cè)序鑒定重組表達(dá)載體。真核表達(dá)載體命名為pcDNA31/HPVl6E7。2轉(zhuǎn)染和抗性細(xì)胞克隆篩選用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體于B16細(xì)胞,孵育3小時(shí)后換液。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),l:5傳代G418800ug/ml篩選,之后每2—3天換液一次。14天后可見(jiàn)抗性細(xì)胞克隆生成,用毛細(xì)管法挑取克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。3陽(yáng)性細(xì)胞克隆鑒定當(dāng)克隆長(zhǎng)滿6孔板時(shí),用Trizol法提取每
3、個(gè)克隆的總RNA。然后以GAPDH為內(nèi)對(duì)照用HPVl6E7引物進(jìn)行RT—PCR檢測(cè)HPVl6E7表達(dá)的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株。結(jié)果:我們成功構(gòu)建含HPVl6E7基因的重組表達(dá)載體,并通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定。經(jīng)該載體轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞,用G418篩選lO—14天后出現(xiàn)抗性克隆。我們用毛細(xì)管法成功挑取克隆,并擴(kuò)大培養(yǎng)。RT—PCR檢測(cè)抗性克隆細(xì)胞,發(fā)l貼,32個(gè)抗性克隆中有24個(gè)克隆HPVl6E7mRNA表達(dá)陽(yáng)性,其中8個(gè)表達(dá)較強(qiáng)。V結(jié)論:1成功構(gòu)建真核
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