表達(dá)HPV16E7可移植小鼠腫瘤細(xì)胞系的初步建立.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文表達(dá)HPV16E7可移植小鼠腫瘤細(xì)胞系的初步建立姓名：謝樹(shù)奪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：王林波2002.5.1塹姿盔堂匿堂墮——————————絲生蘭墮絲羔——一提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)。／方法：＼1重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建沒(méi)計(jì)分別含EcoRI和＆D廳V限制性酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)產(chǎn)生HPVl6E7基因。然后回收純化PCR產(chǎn)物，亞克隆到pGEM—T克隆載體。提取亞克隆質(zhì)粒酶切鑒定后，雙酶切并回收純

2、化切下的HPVl6E7基因。最后，回收產(chǎn)物連接真核表達(dá)載體pcDNA31()，酶切并測(cè)序鑒定重組表達(dá)載體。真核表達(dá)載體命名為pcDNA31／HPVl6E7。2轉(zhuǎn)染和抗性細(xì)胞克隆篩選用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體于B16細(xì)胞，孵育3小時(shí)后換液。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，l：5傳代G418800ug／ml篩選，之后每2—3天換液一次。14天后可見(jiàn)抗性細(xì)胞克隆生成，用毛細(xì)管法挑取克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。3陽(yáng)性細(xì)胞克隆鑒定當(dāng)克隆長(zhǎng)滿6孔板時(shí)，用Trizol法提取每

3、個(gè)克隆的總RNA。然后以GAPDH為內(nèi)對(duì)照用HPVl6E7引物進(jìn)行RT—PCR檢測(cè)HPVl6E7表達(dá)的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株。結(jié)果：我們成功構(gòu)建含HPVl6E7基因的重組表達(dá)載體，并通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定。經(jīng)該載體轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞，用G418篩選lO—14天后出現(xiàn)抗性克隆。我們用毛細(xì)管法成功挑取克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)。RT—PCR檢測(cè)抗性克隆細(xì)胞，發(fā)l貼，32個(gè)抗性克隆中有24個(gè)克隆HPVl6E7mRNA表達(dá)陽(yáng)性，其中8個(gè)表達(dá)較強(qiáng)。V結(jié)論：1成功構(gòu)建真核