結締組織生長因子和金屬蛋白酶組織抑制因子-1聯合RNA干擾研究.pdf

1、目的：結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在許多組織器官纖維化時表達明顯增高，它不僅可直接介導原代肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化、增殖及遷移，還能促進活化HSC合成及分泌細胞外基質(extracel lular matrix，ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，T

2、IMP-1)是近年發(fā)現的一種由巨噬細胞和結締組織細胞產生，可抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)活性的糖蛋白，而MMPs可促進膠原纖維降解，是纖維化的抑制因子。所以，減少CTGF和TIMP-1的表達，可以從不同途徑，減輕纖維化程度。本研究旨在篩選CTGF和TIMP-1的RNA干擾靶位，有效的抑制纖維化。 方法：在GenBank中查詢大鼠CTGF和TIMP-1基因序列，在線設計各3個RN

3、A干擾候選靶位，化學合成雙鏈RNA(dsRNA)，分別命名為CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3，各自轉染或不同組合轉染經TGF-β1刺激活化的大鼠肝星狀細胞，并設立陰性對照組(no-sense)和空白對照組。每組3復孔，測值取均數。48h后抽提RNA并逆轉錄成cDNA通過熒光定量PCR測定CTGF和TIMP-1、procol-α 1mRNACt值，用比較閾值法計算出procol

4、-α 1、CTGF和TIMP-1mRNA的相對表達量，計算抑制率。并取轉染48h后的HSC上清液用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測肝纖維化指標進行比較分析。 結果：熒光定量PCR結果顯示：CTGF-1組、CTGF-2組、CTGF-3組間相互比較，對CTGFmRNA表達均有不同程度的抑制作用，以第三段為靶的“CTGF-3”最佳(CTGFmRNA被抑制率達68.0996)。CTGF三個不同靶位RNA干擾與T

5、IMP-1三個不同靶位干擾聯合作用后，對CTGFmRNA的抑制有不同程度增加，其中以二者的第三靶位聯合干擾對CTGFmRNA的抑制作用增加最多(CTGFmRNA被抑制率達76.60％，較單獨的CTGF第三靶位增加8個百分點)。TIMP-1-1組、TIMP-1-2組、TIMP-1-3組間相互比較，對TIMP-1 mRNA表達均有不同程度的抑制作用，也以第三段為靶的“TIMP-1-3”最佳(TIMP-1mRNA被抑制率達68.55％)。CT

6、GF三個不同靶位RNA干擾與TIMP-1三個不同靶位干擾聯合作用后，對TIMP-1mRNA的抑制有不同程度增加，其中以二者的第三靶位聯合干擾對TIMP-1mRNA的抑制作用增加最多(TIMP-1mRNA被抑制率達78.05％，較單獨的TIMP-1第三靶位增加9個百分點)。單獨的CTGF或TIMP-1所有單個靶位的RNA干擾，均能減少其下游產物Procol-α 1mRNA的轉錄，其中，二者的第三靶位單獨作用時效果最好，抑制率分別可達到65

7、.03％和62.84％；然而，當以這兩個基因不同的靶位組合聯合進行RNA干擾時對Procol-α 1mRNA的轉錄的抑制作用最強者，是CTGF第二靶位與TIMP-1第三靶位組合，抑制率達85.79％。肝纖維化指標檢測結果顯示：單一的CTGF和TIMP-1所有靶位的RNA干擾抑制Ⅲ型膠原、HA、LN表達的比較，分別以第三段為靶的CTGF和第三段為靶的TIMP-1抑制作用最強。CTGF三個不同靶位RNA干擾與TIMP-1三個不同靶位干擾聯合