呼吸道合胞病毒致大鼠腎病多種損傷機(jī)制研究：微小病變型腎病發(fā)病機(jī)理新探索.pdf

1、①呼吸道合胞病毒(RSV)接種大鼠，建立腎病大鼠模型，進(jìn)一步確定RSV在該病發(fā)生發(fā)展中重要作用。②研究彈性蛋白酶(ELA)-a1抗胰蛋白酶(a1-AT)失衡，ELA酶解和所帶強(qiáng)陽電荷在RSV致大鼠腎小球損傷，尿蛋白增加，從而促進(jìn)腎病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。③研究RSV感染細(xì)胞機(jī)理及其對(duì)腎小球?yàn)V過屏障損傷作用。④研究N-脫乙?；福疦-硫酸基轉(zhuǎn)移酶-1(NDSTl)在RSV致大鼠腎病中作用。探討RSV致大鼠腎病多種損傷機(jī)制，為微小病變型腎病

2、(MCNS)發(fā)病機(jī)理的深入研究提供新思路。 方法 1．以不同滴度RSV(6×10<'2>，6x10<'4>，6x10<'6>PFU)接種大鼠，觀察接種后4，8，14，28d(RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,l4>，RSV<,28>)光鏡、電鏡下腎組織結(jié)構(gòu)改變；分析24h尿蛋白、尿糖胺聚糖(GAG)定量及血白蛋白、膽固醇、尿素氮和肌酐變化；并通過原位雜交及空斑形成試驗(yàn)檢測(cè)腎、肺組織RSV。 2．酶底物法和

3、重氮復(fù)鹽顯色法分別檢測(cè)6x10<'6>PFU RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,14>，RSV<,28>組及相應(yīng)正常對(duì)照大鼠血漿ELA和a1-AT活性；間接免疫熒光法觀察ELA在腎臟的表達(dá)和分布。 3．分別用ELA I(0.1μg／ml)和ELAII(0.5μg／ml)、ELA+低分子肝素(LMWH)、魚精蛋白、魚精蛋白+ELA、<,o>乙酰肝素酶(Hpa)、Hpa +ELA等處理體外培養(yǎng) Hela細(xì)胞，以PBS處理為

4、對(duì)照，然后接種 6x10<'1>pFU RSV，或6x10<'1>pFU RSV與LMWH孵育后再接種Hela細(xì)胞，通過原位雜交和空斑形成試驗(yàn)分析RSV感染力。 4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot分別檢測(cè)6x10<'6>PFU RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,l4>，RSV<,28>組及相應(yīng)正常對(duì)照大鼠腎組織NDST-1 mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1．接種RSV后尿蛋白及尿GAG增加

5、，二者呈正相關(guān)關(guān)系，腎小球上皮細(xì)胞足突腫脹融合，尤以6×10<,6>pFU RSV<,l4，28>組表現(xiàn)最為典型，伴低白蛋白血癥，腎組織光鏡和電鏡下改變(足突廣泛融合)與人類MCNS 基本一致，且原位雜交顯示腎小球上皮細(xì)胞／系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中均可見RSVRNA陽性信號(hào)表達(dá)。 2.6×10<'6> PFU RSV各組血漿ELA／al-AT均較正常對(duì)照組增高，且與尿蛋白及尿GAG含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。RSV<,4,8,14

6、>組腎組織均有ELA 表達(dá)，主要分布于腎小球基底膜(GBM)，以．RSV<,l4，8>組較強(qiáng)，與血漿ELA／al-AT變化趨勢(shì)一致，腎小管無明顯ELA表達(dá)。 3．體外實(shí)驗(yàn)Hela細(xì)胞經(jīng)ELA(0.1μg／ml)、魚精蛋白、魚精蛋白+ ELA、npa、Hpa+ELA處理后，RSV感染力較PBS處理對(duì)照組降低，經(jīng)ELA+LMWH：處理后RSV感染力無明顯減低，而RSV先與LMWH孵育后再接種Hela細(xì)胞，則對(duì)細(xì)胞感染力明顯降低。H

7、ela細(xì)胞經(jīng)ELA(0.5μg／ml)處理后明顯脫落。 4.6×10<'6> PFU RSV各組NDST-1 mRNA及蛋白表達(dá)均較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組降低。RSV各組NDST-1 mRNA及蛋白表達(dá)均與尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與尿GAG含量無明顯相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論 1．RSV可致大鼠腎病綜合征。 2．RSV致大鼠腎病發(fā)生發(fā)展過程中，存在ELA—a1-AT失衡，ELA／al-AT增高，可能通過ELA分

8、解GBM上GAG或直接電荷中和致GBM陰離子電荷篩破壞，促進(jìn)蛋白尿發(fā)生發(fā)展。這一機(jī)制在RSV腎病大鼠蛋白尿，尤其是前期蛋白尿形成中可能起重要作用。 3．體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示RSV感染細(xì)胞需通過細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素(HS)，主要通過RSV所帶陽電荷與細(xì)胞表面帶陰電荷的HS結(jié)合而作用；ELA對(duì)HS有降解作用，小劑量EIA可能通過其強(qiáng)陽電荷與細(xì)胞表面帶陰電荷HS結(jié)合，并通過分解細(xì)胞表面HS，致細(xì)胞表面陰電荷減少，RSV不能有效結(jié)合到細(xì)胞表