β-欖香烯抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞及眼內(nèi)種植瘤生長的機制研究.pdf

1、目的：
　　眼內(nèi)黑色素瘤是成人眼內(nèi)主要的原發(fā)性惡性腫瘤，對患者的視力及生命均構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前缺乏控制生長和轉(zhuǎn)移的有效方法。β-欖香烯是從中藥香茅草中提取的有效抗癌成分，具有抗腫瘤譜廣，毒副作用輕微的突出優(yōu)點;目前臨床廣泛用于惡性胸膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤以及其他淺表性腫瘤;但其作用機制尚不明確。故本實驗旨在現(xiàn)有腫瘤研究的基礎(chǔ)上探討β-欖香烯能否抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的生長，能否抑制小鼠眼內(nèi)種植瘤的生長，以及潛在的作用

2、機制，以尋找一種新的能夠有效控制這一眼內(nèi)惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的治療方法。實驗選用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞系作為研究對象，分三部分進行:
　　1、體外實驗:探討β-欖香烯對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及對urokinase-type plasminogen activator(uPA)、uPA receptor(uPAR)、 Matrixmetalloproteinase-2(MMP-2)、MMP-9表達的影響

3、。
　　2、體內(nèi)實驗:應(yīng)用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞建立小鼠眼內(nèi)種植黑色素瘤模型，探討β-欖香烯對小鼠眼內(nèi)種植瘤生長的抑制作用及對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達的影響。
　　3、分子機制:在前兩部分實驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用特異性ERK1/2通路抑制劑U0126，深入探討β-欖香烯對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用、對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響以及對通路ERK1/2磷酸

4、化表達的影響。
　　方法：
　　1、體外實驗部分:首先通過MTS法檢測β-欖香烯對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長的抑制作用、初步摸索出用于后續(xù)實驗的β-欖香烯作用濃度，依據(jù)上述結(jié)果應(yīng)用Transwell法、劃痕實驗檢測β-欖香烯對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，應(yīng)用Real-timePCR、WesternBlot的方法檢測β-欖香烯對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響。
　

5、　2、體內(nèi)實驗部分:實驗選用SPF級C57BL/6J小鼠，在手術(shù)顯微鏡下直視操作，應(yīng)用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞建立小鼠眼內(nèi)黑色素種植瘤模型。建模后3天觀察小鼠眼內(nèi)情況，分別給予眼周注射β-欖香烯和眼周注射空白乳劑，實驗周期結(jié)束后摘取小鼠眼球，通過對腫瘤大小測量、Real-time PCR、免疫組化法、Western Blot法檢測β-欖香烯對腫瘤生長的影響及對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響。

6、>　　3、分子機制:在體內(nèi)外實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用特異性ERK1/2通路抑制劑U0126后，通過Transwell法檢測β-欖香烯對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用、Real-time PCR檢測β-欖香烯對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響、Western Blot法檢測β-欖香烯對uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9蛋白表達以及對通路ERK1/2磷酸化表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1、

7、體外實驗結(jié)果:MTS結(jié)果顯示，在24h、48h、72h時，隨著β-欖香烯作用時間的延長、濃度的增加，對小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞存活率的抑制增強，抑制濃度始于100μM; Transwell法和劃痕實驗結(jié)果顯示β-欖香烯能夠抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;Real-time PCR結(jié)果顯示β-欖香烯在mRNA水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達;免疫組化法和Western Blot法顯示β-欖香烯在蛋白水平抑

8、制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達。
　　2、體內(nèi)實驗結(jié)果顯示:β-欖香烯作用后的腫瘤大小明顯減小;Real-time PCR結(jié)果顯示β-欖香烯在mRNA水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達;免疫組化法和Western Blot法顯示β-欖香烯在蛋白水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達。
　　3、分子機制研究顯示:β-欖香烯、U0126均能抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)

9、移、下調(diào)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達;兩者聯(lián)合作用后，增強了作用效果;隨著β-欖香烯作用時間的延長、藥物濃度的增加對磷酸化ERK1/2表達的抑制作用增強。
　　結(jié)論：
　　1、通過MTT、Transwell、劃痕實驗、免疫組化、PCR、Western Blot檢測手法證實β-欖香烯通過下調(diào)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達而發(fā)揮抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。
　　2、通過對腫瘤