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文檔簡介
1、目的:
近年來,惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅全球人類健康、導(dǎo)致死亡的一大主要疾病?;瘜W(xué)藥物治療仍是目前臨床治療惡性腫瘤的主要手段之一,但由于其毒副作用極大,尤其對(duì)骨髓造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等重要臟器產(chǎn)生的毒性使患者難以維持或接受治療而導(dǎo)致死亡、以及治療后產(chǎn)生的多藥耐藥問題仍然難以克服,因此亟需尋找新的治療藥物或方法。提取自中藥或天然藥物的活性成分具有多靶點(diǎn)作用、生物活性高、多數(shù)藥物毒副作用輕微、且因多靶點(diǎn)作用不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢已成為全球
2、抗腫瘤藥研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。
海南冬青乙醇提取物(Ethanol extract of Ilex hainanensis Merr.,IME)是從冬青科冬青屬植物海南冬青的樹葉中提取得到,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎活性,炎癥與癌癥之間存在著必然的相關(guān)性。因此,本論文在抗炎研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索其抗腫瘤活性,并闡明潛在的分子機(jī)制,為將IME研究成一種新型的抗腫瘤藥提供實(shí)驗(yàn)支撐。
方法:
第一部分:IM
3、E體外抗惡性腫瘤細(xì)胞活性篩選
體外培養(yǎng)BGC-803、MGC-803、SGC-7901、NCI-H460、A549、LETP-a-2、HepG2、SMMC-7721、MHCC、Hep3B、PC-3、MDA-MB-231及Hela13種人源腫瘤細(xì)胞株,B16-F10、H22及Lewis3種鼠源腫瘤細(xì)胞株,采用MTT法或CCK-8法檢測IME對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50(μg/mL)。
第二部分:I
4、ME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖研究
1.IME對(duì)B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤生長的影響
B16-F10細(xì)胞接種至C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下,建立B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠模型,隨機(jī)分為模型組、IME25,50,100,200 mg/kg組和陽性對(duì)照(達(dá)卡巴嗪70 mg/kg)組。分別按上述劑量灌胃給予受試品,模型組灌胃等量溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉);陽性對(duì)照組腹腔注射達(dá)卡巴嗪,
5、每2天1次。每天觀察小鼠狀態(tài)并稱量體重和進(jìn)食量,每3天測量小鼠瘤體積;連續(xù)干預(yù)14天,取瘤,稱量瘤重計(jì)算抑瘤率(%);取部分瘤組織制作石蠟切片,H&E和TUNEL染色;取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟稱重,計(jì)算臟器系數(shù)并進(jìn)行組織學(xué)檢查。
2.IME對(duì)B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠生存期的影響
B16-F10細(xì)胞接種至C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下,建立B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠模型,隨機(jī)分為模型組、I
6、ME50,100,200 mg/kg組和陽性對(duì)照(達(dá)卡巴嗪70 mg/kg)組。分別按上述劑量灌胃給予受試品,模型組灌胃等量溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉);陽性對(duì)照組腹腔注射達(dá)卡巴嗪,每2天1次。連續(xù)干預(yù)14天后,停藥觀察荷瘤小鼠生存時(shí)間,實(shí)驗(yàn)第50天停止觀察,繪制生存曲線,計(jì)算生存延長率。
第三部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖的機(jī)制研究
體外培養(yǎng)B16-F10鼠源惡性黑色素瘤細(xì)胞,IME處理48
7、h后,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察IME對(duì)B16-F10細(xì)胞周期和凋亡的影響;RT-PCR檢測IME對(duì)NF-κB-p65,Bcl-2,Bcl-xL,以及Bax基因表達(dá)的影響;Western blot檢測IME對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CyclinD,CyclinE,CDK4,CDK2)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κcB-p65、抑癌基因P53、及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Bcl-xL,Bax,細(xì)胞色素C)表達(dá)的影響;酶標(biāo)法檢測IME對(duì)Caspases-3,-
8、8,-9活性的影響。
結(jié)果:
第一部分:IME體外抗惡性腫瘤細(xì)胞活性篩選
IME對(duì)受試的13種人源腫瘤細(xì)胞株及3種鼠源腫瘤細(xì)胞株以濃度與時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖,顯示出較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。其中分別對(duì)鼠源B16-F10惡性黑色素瘤細(xì)胞和人源HepG2肝癌細(xì)胞的IC50值最小,抑制作用最強(qiáng)。
第二部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖研究
1.IME抑制B16-F10惡性黑色素瘤
9、荷瘤小鼠腫瘤生長
B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率實(shí)驗(yàn),與模型組比較,IME顯著降低B16-F10荷瘤小鼠的瘤體積和瘤重。IME25,50,100,200 mg/kg組的腫瘤抑制率分別為38.41%、43.01%、49.25%、68.62%。瘤組織的H&E和TUNEL染色顯示IME可引起瘤內(nèi)大面積的組織壞死和細(xì)胞凋亡。IME干預(yù)期間,B16-F10荷瘤小鼠未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)癥狀。組織形態(tài)學(xué)檢查小鼠重要臟器未見異常。
2.
10、IME延長B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠生存時(shí)間
B16-F10荷瘤小鼠生存實(shí)驗(yàn),模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第33天全部死亡,此時(shí)IME50,100,200 mg/kg組分別有70%、80%、90%的小鼠存活。第50天實(shí)驗(yàn)結(jié)束,陽性對(duì)照達(dá)卡巴嗪組小鼠全部死亡,IME100 mg/kg組與IME200 mg/kg組分別有1/10只(10%)、2/10只小鼠(20%)存活。根據(jù)Log-rank時(shí)序檢驗(yàn),與模型組比較,IME在50、10
11、0、200 mg/kg劑量時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的生存延長率分別高達(dá)45.10%、45.10%、62.75%,表明IME可顯著延長荷瘤小鼠生存時(shí)間,IME顯示出顯著的抗惡性黑色素瘤活性。
第三部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖的機(jī)制研究
MTT檢測結(jié)果顯示IME呈時(shí)間與濃度依賴性抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖;流式細(xì)胞儀檢測顯示IME誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞G1/S期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡;RT-
12、PCR檢測結(jié)果顯示IME顯著下調(diào)NF-κB-p65、Bcl-2,Bcl-xL基因表達(dá),同時(shí)顯著上調(diào)Bax基因表達(dá);Western blot檢測結(jié)果顯示IME抑制調(diào)控G1/S細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD,CyclinE,CDK4,CDK2表達(dá),抑制NF-κB-p65入核;顯著下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xL表達(dá),同時(shí)顯著上調(diào)抑癌基因P53及促細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放;酶標(biāo)法檢測結(jié)果顯
13、示IME增加Caspases-3,-8,-9活性。
結(jié)論:
(1)IME體外具有抗惡性腫瘤細(xì)胞活性,以鼠源B16-F10惡性黑色素瘤細(xì)胞與人源HepG2肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為最低,抑制作用最強(qiáng)。
(2)IME有效抑制B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤生長,顯著延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間,且未見毒副反應(yīng)癥狀。
(3)IME可調(diào)控B16-F10小鼠惡性黑色素細(xì)胞內(nèi)G1/S細(xì)胞周期相關(guān)蛋白
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