海南冬青提取物調(diào)控NF-KB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制B16-F10惡性黑色素瘤增殖.pdf

1、目的：
　　近年來，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅全球人類健康、導(dǎo)致死亡的一大主要疾病?；瘜W(xué)藥物治療仍是目前臨床治療惡性腫瘤的主要手段之一，但由于其毒副作用極大，尤其對(duì)骨髓造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等重要臟器產(chǎn)生的毒性使患者難以維持或接受治療而導(dǎo)致死亡、以及治療后產(chǎn)生的多藥耐藥問題仍然難以克服，因此亟需尋找新的治療藥物或方法。提取自中藥或天然藥物的活性成分具有多靶點(diǎn)作用、生物活性高、多數(shù)藥物毒副作用輕微、且因多靶點(diǎn)作用不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢已成為全球

2、抗腫瘤藥研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。
　　海南冬青乙醇提取物(Ethanol extract of Ilex hainanensis Merr.，IME)是從冬青科冬青屬植物海南冬青的樹葉中提取得到，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎活性，炎癥與癌癥之間存在著必然的相關(guān)性。因此，本論文在抗炎研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索其抗腫瘤活性，并闡明潛在的分子機(jī)制，為將IME研究成一種新型的抗腫瘤藥提供實(shí)驗(yàn)支撐。
　　方法：
　　第一部分:IM

3、E體外抗惡性腫瘤細(xì)胞活性篩選
　　體外培養(yǎng)BGC-803、MGC-803、SGC-7901、NCI-H460、A549、LETP-a-2、HepG2、SMMC-7721、MHCC、Hep3B、PC-3、MDA-MB-231及Hela13種人源腫瘤細(xì)胞株，B16-F10、H22及Lewis3種鼠源腫瘤細(xì)胞株，采用MTT法或CCK-8法檢測IME對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50(μg/mL)。
　　第二部分:I

4、ME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖研究
　　1.IME對(duì)B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤生長的影響
　　B16-F10細(xì)胞接種至C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下，建立B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠模型，隨機(jī)分為模型組、IME25，50，100，200 mg/kg組和陽性對(duì)照(達(dá)卡巴嗪70 mg/kg)組。分別按上述劑量灌胃給予受試品，模型組灌胃等量溶媒（0.5％羧甲基纖維素鈉）;陽性對(duì)照組腹腔注射達(dá)卡巴嗪，

5、每2天1次。每天觀察小鼠狀態(tài)并稱量體重和進(jìn)食量，每3天測量小鼠瘤體積;連續(xù)干預(yù)14天，取瘤，稱量瘤重計(jì)算抑瘤率(％);取部分瘤組織制作石蠟切片，H&E和TUNEL染色;取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)并進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　2.IME對(duì)B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠生存期的影響
　　B16-F10細(xì)胞接種至C57BL/6J小鼠右側(cè)腋窩皮下，建立B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠模型，隨機(jī)分為模型組、I

6、ME50，100，200 mg/kg組和陽性對(duì)照(達(dá)卡巴嗪70 mg/kg)組。分別按上述劑量灌胃給予受試品，模型組灌胃等量溶媒（0.5％羧甲基纖維素鈉）;陽性對(duì)照組腹腔注射達(dá)卡巴嗪，每2天1次。連續(xù)干預(yù)14天后，停藥觀察荷瘤小鼠生存時(shí)間，實(shí)驗(yàn)第50天停止觀察，繪制生存曲線，計(jì)算生存延長率。
　　第三部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖的機(jī)制研究
　　體外培養(yǎng)B16-F10鼠源惡性黑色素瘤細(xì)胞，IME處理48

7、h后，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察IME對(duì)B16-F10細(xì)胞周期和凋亡的影響;RT-PCR檢測IME對(duì)NF-κB-p65，Bcl-2，Bcl-xL，以及Bax基因表達(dá)的影響;Western blot檢測IME對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CyclinD，CyclinE，CDK4，CDK2)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κcB-p65、抑癌基因P53、及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2，Bcl-xL，Bax，細(xì)胞色素C)表達(dá)的影響;酶標(biāo)法檢測IME對(duì)Caspases-3，-

8、8，-9活性的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分:IME體外抗惡性腫瘤細(xì)胞活性篩選
　　IME對(duì)受試的13種人源腫瘤細(xì)胞株及3種鼠源腫瘤細(xì)胞株以濃度與時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖，顯示出較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性。其中分別對(duì)鼠源B16-F10惡性黑色素瘤細(xì)胞和人源HepG2肝癌細(xì)胞的IC50值最小，抑制作用最強(qiáng)。
　　第二部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖研究
　　1.IME抑制B16-F10惡性黑色素瘤

9、荷瘤小鼠腫瘤生長
　　B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率實(shí)驗(yàn)，與模型組比較，IME顯著降低B16-F10荷瘤小鼠的瘤體積和瘤重。IME25，50，100，200 mg/kg組的腫瘤抑制率分別為38.41％、43.01％、49.25％、68.62％。瘤組織的H&E和TUNEL染色顯示IME可引起瘤內(nèi)大面積的組織壞死和細(xì)胞凋亡。IME干預(yù)期間，B16-F10荷瘤小鼠未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)癥狀。組織形態(tài)學(xué)檢查小鼠重要臟器未見異常。
　　2.

10、IME延長B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠生存時(shí)間
　　B16-F10荷瘤小鼠生存實(shí)驗(yàn)，模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第33天全部死亡，此時(shí)IME50，100，200 mg/kg組分別有70％、80％、90％的小鼠存活。第50天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，陽性對(duì)照達(dá)卡巴嗪組小鼠全部死亡，IME100 mg/kg組與IME200 mg/kg組分別有1/10只(10％)、2/10只小鼠(20％)存活。根據(jù)Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)，與模型組比較，IME在50、10

11、0、200 mg/kg劑量時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的生存延長率分別高達(dá)45.10％、45.10％、62.75％，表明IME可顯著延長荷瘤小鼠生存時(shí)間，IME顯示出顯著的抗惡性黑色素瘤活性。
　　第三部分:IME抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤增殖的機(jī)制研究
　　MTT檢測結(jié)果顯示IME呈時(shí)間與濃度依賴性抑制B16-F10鼠源惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖;流式細(xì)胞儀檢測顯示IME誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞G1/S期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡;RT-

12、PCR檢測結(jié)果顯示IME顯著下調(diào)NF-κB-p65、Bcl-2，Bcl-xL基因表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bax基因表達(dá);Western blot檢測結(jié)果顯示IME抑制調(diào)控G1/S細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD，CyclinE，CDK4，CDK2表達(dá)，抑制NF-κB-p65入核;顯著下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)抑癌基因P53及促細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放;酶標(biāo)法檢測結(jié)果顯

13、示IME增加Caspases-3，-8，-9活性。
　　結(jié)論：
　　(1)IME體外具有抗惡性腫瘤細(xì)胞活性，以鼠源B16-F10惡性黑色素瘤細(xì)胞與人源HepG2肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為最低，抑制作用最強(qiáng)。
　　(2)IME有效抑制B16-F10惡性黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤生長，顯著延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間，且未見毒副反應(yīng)癥狀。
　　(3)IME可調(diào)控B16-F10小鼠惡性黑色素細(xì)胞內(nèi)G1/S細(xì)胞周期相關(guān)蛋白