Pim-1在前列腺癌中作用機制的初步研究.pdf

1、目的:目前，前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）的發(fā)病率已躍居我國男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。對于晚期PCa以及雄激素非依賴型PCa，基因治療可以作為一種很有前途的治療手段。Pim-1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已有研究顯示Pim-1在細胞凋亡、增殖、分化和腫瘤發(fā)生過程中起重要作用，并證實其在Pca中有高表達。本研究旨在利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)下調(diào)Pim-1基因的表達水平，研究其對PCa細胞在增殖、凋亡及侵

2、襲等方面的影響，并確定Pim-1基因是否可作為PCa基因治療的靶基因，進而為PCa基因治療的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法:利用RT-PCR和Western-blot篩選Pim-1表達水平最高的前列腺癌細胞系作為研究對象。利用相關(guān)軟件設(shè)計、篩選出若干Pim-1 mRNA干擾序列，再通過BLAST及干擾靶點mRNA的二級結(jié)構(gòu)進一步篩選出3條靶向Pim-1mRNA的干擾序列，長度均為19nt，分別靶向674-692、707-725和1

3、080-1098位點。人工合成靶向Pim-1基因的siRNA轉(zhuǎn)錄模板，與shRNA表達載體相連接，成功構(gòu)建針對PIM-1mRNA上述位點的RNAi重組質(zhì)粒pRNAT-U6．1/Neo-Pim1-shRNA-1，-2，-3。重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞，利用RT-PCR和Western-blot檢測Pim-1基因沉默效果，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。利用流式細胞技術(shù)檢測Pim-l基因沉默對前列腺癌細胞的細胞周期及凋亡的影響，利用T

4、ranswell實驗檢測細胞侵襲能力的變化。同時利用RT-PCR和Western-blot檢測Pim-1表達下調(diào)后前列腺癌細胞中原癌基因c-Myc表達的變化情況。制備前列腺癌裸鼠移植瘤模型，腫瘤局部注射針對Pim-1基因的RNAi重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體，觀察前列腺癌組織細胞內(nèi)Pim-1基因的沉默效果及RNAi重組質(zhì)粒對前列腺癌在動物體內(nèi)生長的抑制作用。RT-PCR和Western-blot檢測中均以GAPDH的表達水平作內(nèi)參照。 結(jié)果

5、:RT-PCR檢測顯示3個RNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后Pim-1 mRNA表達的相對量分別為0．324±0．025、0．136±0．013、0．125±0．016，與PBS對照組（表達量為1．078±0．132）相比均明顯下降（P<0．05）。與重組質(zhì)粒-1相比，RNAi重組質(zhì)粒-2，-3具有更強的Pim-1基因沉默效應(yīng)（P<0．05）。Western-blot檢測顯示，與PBS對照組相比這2個RNAi重組質(zhì)粒均可以顯著降低Pim

6、-1蛋白的表達水平。將靶向1080-1098位點的RNAi重組質(zhì)粒-3以脂質(zhì)體為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PC-3細胞，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。與PBS對照組相比，Pim-1基因沉默PC-3細胞的增殖速度、克隆形成能力及致瘤能力均顯著下降，細胞周期中G1期細胞的比例升高而S期細胞的比例降低，說明G1期→S期進程受阻。Pim-1基因沉默對前列腺癌細胞的侵襲能力并無顯著影響。而且，Pim-1基因沉默前列腺癌細胞中c-Myc蛋白水平顯著降低（沉默組和PBS對照組

7、c-Myc蛋白相對量分別為0．384±0．041和0．866±0．079，P<0．05），而其mRNA水平卻無明顯變化（沉默組和PBS對照組c-MycmRNA相對量分別為0．986±0．158和1．027±0．105，P>0．05）。與PBS對照組相比，種植瘤組織內(nèi)注射Pim-1 RNAi重組質(zhì)粒-3可以有效降低前列腺癌細胞內(nèi)Pim-1 mRNA水平（Pim-1 mRNA的相對量分別為1．113±0．048和0．437±0．013，P<

8、0．05）和Pim-1蛋白水平（Pim-1蛋白相對量分別為0．948±0．097和0．378±0．048，P<0．05）。另外，注射重組質(zhì)?？梢燥@著抑制裸鼠皮下種植瘤的生長，重組質(zhì)粒組和PBS對照組種植瘤的最后重量分別為0．33±0．08g和0．68±0．14g（P<0．05）。PBS對照組和空質(zhì)粒對照組在各項指標檢測中均無顯著差異（P>0．05）。 結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了針對Pim-1 mRNA的RNAi重組質(zhì)粒表達載體，并驗

9、證了靶向不同位點重組質(zhì)粒載體的基因沉默效果。重組載體在脂質(zhì)體的協(xié)助下能夠高效的轉(zhuǎn)染PC-3細胞，靶向Pim-1 mRNA1080-1098位點的RNAi重組質(zhì)粒能夠有效的在轉(zhuǎn)錄后水平抑制前列腺癌細胞Pim-1基因的表達，并使PC-3細胞的細胞周期受到阻滯，抑制了細胞的增殖，同時誘發(fā)細胞凋亡。Pim-1可以在蛋白水平調(diào)控c-Myc的表達，對抑制腫瘤生長可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。裸鼠種植瘤模型的動物體內(nèi)抑瘤實驗顯示，Pim-1可以作為前列腺癌基因治