miR-29b在前列腺癌中的表達(dá)及其作用和機(jī)制的初步探討.pdf

1、第一部分 miR-29b在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　目的:探討miR-29b在前列腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法:用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測10例前列腺癌(PCa)及癌旁非腫瘤組織中miR-29b的表達(dá)情況，研究其與PCa病理分期、分級之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:10例前列腺癌組織(prostate cancer, PCa)與配對的癌旁非腫瘤組織相比，miR-29b在PCa中的表達(dá)明顯下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

2、p＜0.05)。根據(jù)TNM病理分期，其中T1-T2患者7例和T3b患者3例，兩組的miR-29b無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);根據(jù)Gleason評分進(jìn)行病理分級，其中G1-G2患者4例，G3-G4患者6例，兩組miR-29b表達(dá)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05）。
　　結(jié)論:(1) miR-29b在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。
　　(2) miR-29b的表達(dá)與PCa病理分期及病理分級沒有明顯相關(guān)性。
　　第二

3、部分 miR-29b在不同前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　目的:探討miR-29b在不同前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其與細(xì)胞惡性程度和雄激素依賴性的相關(guān)性，選擇miR-29b表達(dá)相對較低的細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　方法:選取PC3、DU145、LNCap、LNCap-AI四種細(xì)胞系，其中PC3、DU145、LNCap為來源不同的細(xì)胞系。PC3和DU145具有惡性程度高且雄激素非依賴生長的特點(diǎn)，LNCap惡性程度低且雄激素依賴生長，

4、而LNCap和LNCap-AI來源相同，LNCap-AI為LNCap在逐步去雄激素環(huán)境下培養(yǎng)出的雄激素非依賴細(xì)胞。用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測這四種前列腺癌細(xì)胞株中miR-29b的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:四種前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平由高到低分別為DU-145、PC-3、LNCap、LNCap-AI，四組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。其中DU-145、PC-3中的miR-29b表達(dá)水平明顯高于LNCap，而LNCap細(xì)胞中miR-29

5、b表達(dá)水平高于LNCap-AI細(xì)胞。
　　結(jié)論:(1) miR-29b在不同的前列腺癌細(xì)胞系中有不同的表達(dá)水平，且與雄激素非依賴性轉(zhuǎn)化過程有相關(guān)性。
　　(2) LNCap細(xì)胞株中miR-29b表達(dá)相對較低，選擇LNCap細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分 miR-29b對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:探討miR-29b對前列腺癌細(xì)胞化療藥物敏感性、細(xì)胞周期、增殖、凋亡及侵襲能力等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

6、。
　　方法:構(gòu)建miR-29b模擬物片段及干預(yù)序列，并轉(zhuǎn)染到LNCap細(xì)胞中。在熒光鏡下計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并用實(shí)時(shí)定量PCR檢測LNCap轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中miR-29b的表達(dá)水平。分別用MTT法檢測上調(diào)miR-29b對順鉑化療作用的影響，觀察細(xì)胞的存活率的變化，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，AV/PI雙標(biāo)法FCM檢測細(xì)胞的凋亡情況，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞浸襲能力。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建miR-29b模擬物片段及干預(yù)

7、序列，并轉(zhuǎn)染到LNCap細(xì)胞中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上。與陰性對照組相比:miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞細(xì)胞存活率明顯下降，而miR-29b模擬物加順鉑組細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，miR-29b可以增加癌細(xì)胞對順鉑的化療敏感性;miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染組亞G0/G1期明顯增加，G0/G1期、S期、G2/M期比例均減少，癌細(xì)胞增殖能力下降;AV/PI雙標(biāo)法FCM試驗(yàn)顯示miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總凋亡率明顯下降;Transwell

8、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少。
　　結(jié)論:miR-29b高表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并且增加癌細(xì)胞對化療藥物敏感性。
　　第四部分前列腺癌中miR-29b作用靶基因的初步篩查
　　目的:初步探討前列腺癌中miR-29b可能的作用靶基因。
　　方法:生物信息學(xué)技術(shù)及查閱文獻(xiàn)的方法預(yù)測miR-29b可能的靶基因，Western-blot檢測LNCap細(xì)胞

9、株中各預(yù)測靶基因蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測出8個(gè)miR-29b可能作用的靶基因:SOCS-1、Mcl-1、DNMT3b、MMP2、IFN-γ、SMAD3、SOCS5、AKT3。WB檢測miR-29b表達(dá)變化后8種可能靶基因的蛋白變化，其中AKT3、Mcl-1和DNMT3b的蛋白表達(dá)在miR-29b模擬物轉(zhuǎn)染組有明顯下降，在miR-29b抑制物轉(zhuǎn)染組有明顯上升(P＞0.05)。
　　結(jié)論:AKT3、Mcl