臍血干細(xì)胞定向分化及治療肝衰竭的實驗與臨床研究.pdf

1、目的：通過細(xì)胞培養(yǎng)及動物實驗探討人臍血干細(xì)胞(humanumbilicalcordbloodstemcell，HUCBSC)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下及動物體內(nèi)定向分化為有一定功能的肝細(xì)胞的條件及能力；HUCBSC和臍血漿對實驗動物肝衰竭的治療效果及其可能機(jī)理。通過臨床治療及隨訪觀察人臍血干細(xì)胞移植(humanumbilicalcordbloodstemcelltransplantation，HUCBSCT)治療重型病毒性肝炎的臨床療效和不良反應(yīng)

2、，為建立HUCBSCT治療重型肝炎的新方法提供實驗和臨床依據(jù)。 方法：在HUCBSC定向分化為肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，采集人臍帶血(humanumbilicalcordblood，HUCB)分離單個核細(xì)胞后，在實驗組培養(yǎng)瓶內(nèi)加入成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)及促肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)或FGF加胎肝上清液培養(yǎng)，對照組培養(yǎng)瓶內(nèi)只加FGF培養(yǎng)。

3、觀察細(xì)胞生長分化狀況，免疫組化檢測人甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)和人白蛋白(albumin,ALB)。 在HUCBSC分化為肝細(xì)胞的動物實驗中采用密度梯度離心法分離人臍帶血單個核細(xì)胞(humanumbilicalcordbloodmononuclearcell，HUCBMNC)。SD大鼠一次性腹腔注射10％(V/V)四氯化碳(carbontetrachloride，CCL4)建立急性肝損傷模型。將48小時

4、后存活的大鼠隨機(jī)分為人臍血清治療組(A組)、HUCBMNC輸注治療組(B組)、HUCBMNC輸注+免疫抑制劑治療組(C組)。觀察各組大鼠的一般情況并于處理后的不同時間分別隨機(jī)處死各組大鼠，取大鼠肝臟組織作病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠肝組織中人AFP及人ALB，用人X染色體上的XIST(Xinactive-specifictranscript)基因設(shè)計引物，從大鼠石蠟包埋肝臟組織中提取DNA，進(jìn)行PCR及凝膠電泳分析以檢測大鼠肝臟

5、組織DNA中是否存在人類DNA。 在臍血漿治療大鼠肝衰竭實驗中，經(jīng)腹腔內(nèi)注射CCL4建立大鼠急性肝衰竭模型后，大鼠隨機(jī)分為四組：第一組為對照組，第二組為生理鹽水組，第三組為成人血漿組，第四組為臍血漿組。觀察大鼠的存活率、ALT、TBIL及AFP值，并取大鼠肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。 在HUCBSCT治療重型肝炎的臨床觀察實驗中，以低溫離心法分離HUCBSC。重型病毒性肝炎病人被隨機(jī)分為四組：第一組為對照(成人血漿)組，第

6、二組為HUCBSCT組，第三組為血漿置換(plasmaexchange，PE)組，第四組為HUCBSCT+PE組。對照組及PE組的病人輸注成人血漿，HUCBSCT組及HUCBSCT+PE組的病人輸注HUCBSC。觀察病人治療前后血ALB、ALT、TBIL、PTA的變化，以及副作用與安全性。并對部分病人進(jìn)行了療效隨訪。 結(jié)果：HUCBSC定向分化為肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示對照組貼壁細(xì)胞形態(tài)大多為梭形細(xì)胞，可能為成纖維細(xì)胞，未見

7、多邊形細(xì)胞。實驗組細(xì)胞形態(tài)除梭形細(xì)胞外，還可見圓形，類圓形及多邊形細(xì)胞，呈類肝細(xì)胞形態(tài)。實驗組培養(yǎng)細(xì)胞的AFP，ALB免疫組化染色為陽性。而對照組培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)AFP，ALB免疫組化染色后未見陽性細(xì)胞。此外，采用肝素作為抗凝劑采集的HUCBMNC生長分化優(yōu)于采用枸椽酸鈉作為抗凝劑者；HGF的誘導(dǎo)分化效果優(yōu)于胎肝上清液。 HUCBSC分化為肝細(xì)胞的動物實驗結(jié)果顯示A組大鼠肝臟組織中未見人AFP及人ALB陽性細(xì)胞，B組及C組大鼠第21天

8、和1月時可見到部分人AFP和人ALB陽性細(xì)胞，主要分布于匯管區(qū)、肝竇和肝小葉中央靜脈周圍，部分陽性細(xì)胞內(nèi)可見雙核。B組和C組大鼠在21天和(或)1月時肝臟內(nèi)可以檢測到人X染色體基因片段存在，在A組大鼠肝臟內(nèi)未見到此片段PCR產(chǎn)物。 臍血漿治療大鼠肝衰竭實驗結(jié)果顯示臍血漿組大鼠存活率高于成人血漿組、生理鹽水組及對照組。臍血漿組大鼠ALT及TBIL值低于成人血漿組、生理鹽水組及對照組。同時臍血漿組的AFP值高于其它三組。大鼠肝組織病

9、理學(xué)結(jié)果顯示經(jīng)過五天的臍血漿治療后，肝細(xì)胞壞死及單核細(xì)胞浸潤明顯減輕，僅見點狀肝細(xì)胞壞死，同時可見肝細(xì)胞再生。對照組及生理鹽水組可見多小葉的肝細(xì)胞壞死及大量的淋巴細(xì)胞浸潤，沒有明顯的肝細(xì)胞再生。在成人血漿組可見局灶性壞死、中度淋巴細(xì)胞浸潤及少數(shù)局灶性肝細(xì)胞再生。 HUCBSCT治療重型肝炎的臨床觀察實驗結(jié)果顯示各組病人治療后ALB及PTA均有升高，但HUCBSCT組、PE組及HUCBSCT+PE組升高幅度明顯高于對照組，HUCB

10、SCT組、PE組及HUCBSCT+PE組的TBIL在治療后明顯降低。病人療效隨訪結(jié)果顯示在隨訪期間內(nèi)HUCBSCT組病人的ALB值高于對照組。在治療過程中HUCBSCT組未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)及移植物抗宿主病。 結(jié)論：以上細(xì)胞培養(yǎng)、動物實驗及臨床治療觀察結(jié)果提示： 1.臍帶血干細(xì)胞在促肝細(xì)胞生長因子或胎肝上清液的誘導(dǎo)下可以定向分化為能分泌白蛋白及甲胎蛋白的肝細(xì)胞。 2.人臍帶血干細(xì)胞可以在無免疫缺陷的急性肝損傷SD大鼠體