MARVELD1調控粘附相關基因mRNA加工和NMD機制的研究.pdf

1、細胞的無限增殖以及向周圍組織侵襲轉移是惡性腫瘤的兩大重要的生物學特征，也是腫瘤致死率居高不下的關鍵原因。細胞的侵襲運動能力增強是腫瘤擴散的直接原因。多年來，研究者致力于揭示調控腫瘤細胞遷移運動的分子機制，但是到目前為止還遠未完全闡明。
　　MARVELD1基因是本研究室在前期工作中獲得的一個功能未知的新基因，全基因表達譜分析的結果顯示：MARVELD1主要影響了mRNA加工通路和粘著斑信號通路相關基因的表達，同時還對MAPK細胞增

2、殖通路的部分基因的表達有一定的影響。在前期工作中，MARVELD1對多種腫瘤細胞（尤其是肝癌細胞）增殖的影響均已得到了證實。此外，在前期的相互作用蛋白篩選中，研究發(fā)現(xiàn)MARVELD1與importinβ1存在相互作用。importinβ1是一類經(jīng)典的介導核質運輸?shù)年P鍵蛋白，參與了多種分子生物學通路，包括RNA的5′帽子結合蛋白CBP80和CBP20的核質循環(huán)、無義介導的RNA降解機制（NMD）等。NMD是一種RNA質量監(jiān)控機制，大量研究

3、表明，mRNA加工可能會激發(fā) NMD通路活性。因此，本課題主要致力于解析MARVELD1與細胞黏附及相關聯(lián)的細胞鋪展和遷移運動、細胞粘附相關基因表達及其mRNA加工通路以及NMD機制的相關性。
　　細胞鋪展是細胞侵襲運動的關鍵一步，而細胞與細胞外基質之間的粘附力是細胞鋪展過程的基本驅動力之一。首先，本研究分析了MARVELD1對A549、H520以及NIH3T3細胞鋪展過程的影響。實驗結果表明MARVELD1負調控了以上細胞的鋪展

4、速率和面積。進一步的細胞粘附實驗結果顯示MARVELD1負調控A549和H520細胞與細胞外基質成分Collagen I以及Laminin V之間的粘附作用。在此基礎上，通過劃痕實驗分析了MARVELD1對細胞遷移運動的影響，結果顯示MARVELD1正調控了人肺癌細胞A549和H520的遷移能力。
　　細胞粘附是細胞侵襲運動的重要驅動力。為進一步研究MARVELD1影響細胞遷移運動的分子機制，本研究檢測了MARVELD1對細胞粘附

5、相關基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)MARVELD1主要調控了FAK第397位酪氨酸的磷酸化水平以及integrinβ4、paxillin和integrinβ1的蛋白表達。結合前期的全基因表達譜分析結果，本研究重點分析了MARVELD1對以上三個基因的pre-mRNA和mRNA的相對含量的影響，發(fā)現(xiàn)MARVELD1可能主要調控integrinβ1基因的mRNA加工過程。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MARVELD1定位于RNA加工主要場所speckle小體，并

6、與RNA的5′帽子結合蛋白CBP20存在相互作用。由于RNA加工過程與NMD機制相偶聯(lián)，而且 CBP20是參與NMD機制的重要因子，所以該結果提示：MARVELD1可能也參與了NMD通路。
　　為明確 MARVELD1與NMD通路的相關性，本研究分析了MARVELD1對NMD報告基因和已知的內源靶轉錄本的穩(wěn)定性的影響，結果顯示MARVELD1顯著提高它們的穩(wěn)定性，因此也證實MARVELD1抑制了NMD通路活性。在研究其分子機制中，

7、發(fā)現(xiàn)MARVELD1與重要的NMD因子UPF1和Y14存在相互作用，而且確定了MARVELD1與UPF1相互作用的關鍵氨基酸區(qū)域。MARVELD1抑制了UPF1與SMG1的相互作用，卻促進了UPF1與importinβ1相結合。由于SMG1是UPF1的磷酸化激酶，所以本研究進一步探討了UPF1的磷酸化水平，結果顯示MARVELD1抑制了UPF1的絲氨酸磷酸化水平，阻斷了后續(xù)SMG5與UPF1的相互作用。因此，綜合上述實驗結果，MARVE

8、LD1通過與UPF1相互作用抑制其絲氨酸磷酸化，阻斷后續(xù)的SMG5介導的RNA降解進程，進而抑制NMD通路活性。
　　綜上所述，本研究證實MARVELD1負調控了人肺癌細胞A549和H520的鋪展及粘附能力，正調控了二者的遷移運動能力；影響了多種細胞粘附相關蛋白integrinβ1、integrinβ4、α-actinin、vinculin、paxillin、moesin、p-FAK（Y397）等的表達，對于integrinβ1基