多肽偶聯(lián)殼聚糖納米粒給藥載體的構(gòu)建及其體外靶向分布研究.pdf

1、目的:
　　合成多肽偶聯(lián)殼聚糖，制備多肽偶聯(lián)殼聚糖川芎嗪納米粒(多肽殼聚糖納米粒， pEGF-CS-TMP-NPs)，研究其體外靶向性與靶向分布機(jī)制。
　　方法:
　　1.氧化降解法制備低分子量殼聚糖。烏氏粘度計測定不同濃度過氧化氫、不同降解時間下殼聚糖的特性黏度，Mark-Houwink方程計算殼聚糖分子量。分析殼聚糖降解前后紅外光譜結(jié)構(gòu)表征。
　　2.以2-亞氨基硫烷鹽酸鹽為偶合劑制備巰基殼聚糖，優(yōu)化巰基殼聚

2、糖合成工藝。將表皮生長因子受體(EGFR)特異性配體多肽(pEGF)通過分子內(nèi)二硫鍵修飾于巰基殼聚糖表面合成多肽偶聯(lián)殼聚糖。紅外光譜、核磁共振光譜分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征。各產(chǎn)物元素含量通過元素分析儀測定。
　　3.離子交聯(lián)法制備多肽殼聚糖納米粒，透射電鏡觀察多肽殼聚糖納米粒的形態(tài)，激光粒度分析儀測定粒徑、分散度、Zeta電位，高效液相色譜法測定包封率、載藥量。
　　4.體外恒溫振蕩法模擬體內(nèi)釋藥環(huán)境，對多肽殼聚糖納米粒組、殼聚糖

3、川芎嗪納米粒組（殼聚糖納米粒）、川芎嗪溶液組釋藥情況分別進(jìn)行考察。pH值為7.4、7.0、6.5，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、96、120h取樣，高效液相色譜法檢測各組藥物濃度，計算各組累計釋放度。
　　5.MTT法檢測細(xì)胞毒作用。選取人肝癌細(xì)胞SMMC-7721（EGFR高表達(dá)）、人白血病細(xì)胞K562(EGFR陰性表達(dá))。分別給予濃度為0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、0.62mg·mL

4、-1的多肽殼聚糖納米粒和相當(dāng)載體量的空納米粒，給藥48h，吸光度通過酶標(biāo)儀檢測。用origin軟件計算兩種細(xì)胞、兩種制劑的IC95。
　　6.多肽殼聚糖納米粒體外靶向分布研究。實驗組SMMC-7721給予無毒劑量的多肽殼聚糖納米粒，對照組SMMC-7721給予相應(yīng)劑量殼聚糖納米粒以及川芎嗪溶液，K562給予相應(yīng)劑量的多肽殼聚糖納米粒。分別作用1、2、4、6、8、10h時取樣，高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)川芎嗪濃度。給藥4h，激光共聚焦

5、顯微鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪熒光強(qiáng)度。
　　7.競爭結(jié)合實驗探討多肽殼聚糖納米粒靶向分布機(jī)制。選取SMMC-7721與K562細(xì)胞，給予無毒劑量的多肽殼聚糖納米粒;對照組選取上述兩種細(xì)胞，分別用游離pEGF進(jìn)行處理，再加入多肽殼聚糖納米粒。作用4h后，各組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪熒光強(qiáng)度通過激光共聚焦顯微鏡檢測。
　　結(jié)果:
　　1.殼聚糖的相對分子質(zhì)量隨降解反應(yīng)時間的延長而降低，且過氧化氫濃度越大降解效率越高。選取3％過氧化氫、降

6、解90min為反應(yīng)條件，得到殼聚糖分子量約為3×104作為合成巰基殼聚糖原料。紅外結(jié)果表明降解后殼聚糖結(jié)構(gòu)單元并沒有改變，僅β糖苷鍵發(fā)生斷裂。
　　2.合成巰基殼聚糖。與殼聚糖相比，其紅外圖譜在1621cm-1新出現(xiàn)-C=N的伸縮振動峰。核磁圖譜顯示，巰基殼聚糖在δ2.7、δ1.9處出現(xiàn)新的位移值，說明巰基連接到殼聚糖分子表面。在對巰基殼聚糖工藝優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，在pH=6.2時，巰基含量較高，并選擇殼聚糖與2-亞氨基硫烷鹽酸鹽的質(zhì)

7、量比為2∶1用于制備巰基殼聚糖。所合成的多肽偶聯(lián)殼聚糖核磁圖譜與殼聚糖相比，δ7.1，δ7.0，δ6.8處新增加三個位移值，分析此為氨基酸中的芳香氫。元素分析結(jié)果顯示，多肽殼聚糖中N、S的含量都有所增加，因此可以判斷pEGF已偶聯(lián)到殼聚糖分子上。
　　3.HPLC法測得多肽殼聚糖納米粒的包封率為37.66±0.53％，載藥量為3.24±0.37％。激光粒度儀測得該納米粒的粒徑為164.3±7.1nm，分散度(PDI)為0.053±

8、0.006，Zeta電位為19.73±2.18mv。多肽殼聚糖納米粒形態(tài)成圓球形，分布均勻。
　　4.釋放度結(jié)果顯示多肽殼聚糖納米粒具有緩釋作用，當(dāng)pH為7.4，釋放時間120h時，累積釋放度達(dá)到91％。隨著pH值降低，多肽殼聚糖納米粒累積釋放度升高，在pH6.5條件下，納米粒累積釋放度最高。
　　5.多肽殼聚糖納米粒對SMMC-7721、K562的0.153 mg·mL-1、0.253 mg·mL-1?？占{米粒對兩種細(xì)胞的

9、IC95約為0.8 mg·mL-1。
　　6.經(jīng)HPLC方法測定，隨著給藥時間的延長，兩種細(xì)胞內(nèi)藥物濃度均增加，4h達(dá)到飽和。經(jīng)給藥SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)濃度由高到低依次為多肽殼聚糖納米粒組(37.53±0.28μg·mL-1)、殼聚糖納米粒組(26.67±0.36μg·mL-1)、溶液組(23.51±0.25μg·mL-1)。K562組藥物濃度為25.81±0.58μg·mL-1。多肽殼聚糖納米粒組細(xì)胞內(nèi)濃度與其它組相比均有顯

10、著性差異(p＜0.05)。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪熒光強(qiáng)度顯著高于對照組。
　　7.激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，加入游離pEGF后，SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)藥物熒光強(qiáng)度顯著降低，K562細(xì)胞內(nèi)藥物熒光強(qiáng)度無變化。說明多肽殼聚糖納米粒的靶向機(jī)制是通過特異性識別EGFR進(jìn)入細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　本實驗合成了新型給藥載體材料多肽偶聯(lián)殼聚糖，制備了理化性質(zhì)穩(wěn)定的多肽殼聚糖川芎嗪納米粒，粒徑小于200nm，