葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒的制備及體外靶向性研究.pdf

1、目的:
　　 制備理化性質(zhì)穩(wěn)定的葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒（主動(dòng)靶向納米粒），研究其體外細(xì)胞靶向性，并初步探討體外靶向分布的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.氧化降解法降解殼聚糖。烏氏粘度計(jì)測(cè)定不同降解時(shí)間殼聚糖的特性粘度，代入Mark-Houwink方程計(jì)算分子量。紅外光譜分析殼聚糖、降解殼聚糖的特征吸收峰。
　　 2.氨基?；磻?yīng)合成葉酸殼聚糖。做紅外圖譜和核磁共振圖譜，對(duì)葉酸殼聚糖結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行分析;紫外分

2、光光度法檢測(cè)每分子殼聚糖上偶聯(lián)的葉酸數(shù)。
　　 3.離子交聯(lián)法制備主動(dòng)靶向納米粒。用分子量、偶聯(lián)數(shù)不同的葉酸殼聚糖制備納米粒，分別對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。HPLC法檢測(cè)包封率、載藥量，激光粒度分析儀檢測(cè)粒徑，透射電鏡觀察形態(tài)，體外恒溫振蕩法考察體外釋藥特性。
　　 4.將順濃度梯度的主動(dòng)靶向納米粒和空白納米粒分別作用于葉酸受體高表達(dá)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和葉酸受體陰性表達(dá)的人肺腺癌A549細(xì)胞，MTT法檢測(cè)主動(dòng)靶向納米粒的細(xì)

3、胞毒性。計(jì)算不同藥物濃度下各細(xì)胞的生長(zhǎng)率，選取納米粒的無毒劑量（95％的細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物濃度）為給藥劑量。
　　 5.主動(dòng)靶向納米粒的細(xì)胞靶向分布研究。實(shí)驗(yàn)組用無毒劑量的主動(dòng)靶向納米粒作用于MCF-7細(xì)胞，對(duì)照組用相應(yīng)的被動(dòng)靶向納米粒和川芎嗪溶液分別作用于MCF-7細(xì)胞，陰性對(duì)照組用無毒劑量的主動(dòng)靶向納米粒作用于A549細(xì)胞。分別作用不同時(shí)間后，HPLC法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪的濃度。激光共聚焦顯微鏡觀察給藥4小時(shí)后各組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪

4、的熒光強(qiáng)度。
　　 6.飽和受體法研究細(xì)胞靶向分布機(jī)制。實(shí)驗(yàn)組選用MCF-7細(xì)胞、A549細(xì)胞，分別給予高、中、低濃度的主動(dòng)靶向納米粒處理;對(duì)照組另選上述2種細(xì)胞，分別給予游離的葉酸進(jìn)行處理，再給予高、中、低濃度的主動(dòng)靶向納米粒。作用4小時(shí)后，取樣處理，HPLC法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)川芎嗪的濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1.殼聚糖分子量的降低與降解反應(yīng)時(shí)間呈依賴性。當(dāng)降解反應(yīng)2小時(shí)后，殼聚糖的分子量為5萬，化學(xué)結(jié)構(gòu)單元不

5、發(fā)生變化，僅β糖苷鍵發(fā)生斷鍵。
　　 2.與葉酸、殼聚糖紅外圖譜進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)合成后的葉酸殼聚糖在1560cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，證明殼聚糖的游離氨基與葉酸的羧基形成了酰胺鍵。與殼聚糖核磁氫圖譜相比，葉酸殼聚糖在位移值3.26ppm和3.72ppm峰的積分強(qiáng)度增加，證明葉酸成功偶聯(lián)到殼聚糖骨架上。經(jīng)紫外分光光度法測(cè)得，當(dāng)葉酸與殼聚糖摩爾配比為170∶1時(shí)，每分子殼聚糖上所偶聯(lián)的葉酸數(shù)為34個(gè)。
　　 3.制備出的主

6、動(dòng)靶向納米粒粒徑為182.7±0.56nm，包封率為59.6±0.23％，載藥量為15.3±0.16％，納米粒成圓球形，分散性好。主動(dòng)靶向納米粒具有緩釋作用，體外緩慢釋藥到第3天，累積釋放度可達(dá)95％，在偏酸性(pH6.5)介質(zhì)中釋藥較中性(pH7.4)介質(zhì)釋藥快。
　　 4.主動(dòng)靶向納米粒對(duì)MCF-7、A549細(xì)胞的無毒劑量是0.25mg·mL-1（其中川芎嗪的濃度為50μg·mL-1），空白納米粒在給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)2種細(xì)胞無

7、細(xì)胞毒性。
　　 5.主動(dòng)靶向納米粒作用于MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度與給藥時(shí)間呈依賴性，給藥4小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)川芎嗪的濃度為45.47±0.32μg·mL-1，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)藥物濃度峰值，顯著高于被動(dòng)靶向納米粒組（22.10±1.02μg·mL-1）、川芎嗪溶液組（4.57±0.76μg·mL-1）和陰性對(duì)照組(20.10±0.92·mL-1)p＜0.01。激光共聚焦顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞內(nèi)川芎嗪的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組

8、及陰性對(duì)照組。
　　 6.經(jīng)高、中、低劑量的主動(dòng)靶向納米粒處理4小時(shí)后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)川芎嗪的濃度分別為8.00±0.40μg·mL-1、45.47±0.32μg·mL-1、63.00±3.44μg·mL-1;對(duì)照組MCF-7細(xì)胞內(nèi)川芎嗪濃度分別為4.30±0.40μg·mL-1、26.47±0.86μg·mL-1、43.2±2.82μg·mL-1，兩組各給藥劑量下細(xì)胞內(nèi)濃度均具有顯著性差異。證明加游離葉酸后，主動(dòng)靶向納米粒不

9、能有效的被MCF-7細(xì)胞攝取。A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)川芎嗪濃度無顯著性差異，表明游離的葉酸不影響A549細(xì)胞對(duì)主動(dòng)靶向納米粒的攝取。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)合成了對(duì)葉酸受體具有較高的親和性的葉酸殼聚糖偶聯(lián)物。制備出的葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒粒徑較小，包封率和載藥量較高，分散均勻，具有緩釋作用。此制劑對(duì)葉酸受體高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞具有靶向性。靶向分布機(jī)制可能是通過細(xì)胞表面葉酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)的。