CCK-8對CIA小鼠脾細胞增殖及Th1-Th2細胞因子平衡的影響.pdf

1、目的：類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的慢性炎癥性自身免疫性疾病。其病理變化為中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和T細胞浸潤關節(jié)，導致滑膜的增生和新生血管的生成；這些細胞可釋放出過量的趨化因子使更多的細胞聚集于炎性部位，并釋放基質(zhì)蛋白酶和細胞因子導致關節(jié)的破壞。目前臨床和實驗均表明：在RA的誘導和急性期以Th1型細胞因子的產(chǎn)生為主，而在疾病的緩解期與Th2介導的反應相關，提示抗原誘導的Th1/

2、Th2細胞免疫應答失衡及炎癥反應是其主要發(fā)病機制。 CIA(collagen-induced arthritis)為膠原誘導性關節(jié)炎，是用Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，C Ⅱ)免疫對其敏感的鼠類，誘導多關節(jié)發(fā)生炎癥，其與人類的RA在臨床表現(xiàn)、組織學和免疫學特征方面很相近.CIA動物模型被認為是研究人類RA發(fā)病機制和探索治療新方法的良好動物模型。 膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是廣泛分布于

3、體內(nèi)多個系統(tǒng)的神經(jīng)肽，作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)發(fā)揮重要作用，具有多種生物學功能℃CK-8是具有CCK全部活性的最小單位。CCK通過與細胞膜上的CCK受體結(jié)合介導其生理調(diào)節(jié)功能。研究已證實在巨噬細胞、T細胞、B細胞均表達CCK受體，說明CCK對免疫系統(tǒng)多靶位的廣泛作用。最近研究表明CCK-8具有一定的抗內(nèi)毒素休克和緩解類風濕性關節(jié)炎的作用，CCK-8對鈅孔戚血藍蛋白誘導的小鼠Th1/Th2細胞反應具有調(diào)節(jié)作用，可抑制Th1型細胞因子IFN-γ的

4、表達，增加Th2型細胞因子IL-4的表達。但CCK-8是否對CIA小鼠具有調(diào)節(jié)作用，其免疫學機制如何尚未見報道?因此本實驗通過觀察CCK-8對CIA小鼠脾細胞增殖和Th1/Th2細胞因子平衡的影響，探討CCK-8在RA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機制，為治療RA尋找新的靶點。方法：1健康的DBA/1小鼠18只，隨機分為正常對照組(6只)和CIA組(12只)，造模第30天取正常對照組和CIA組小鼠的脾細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105cell/孔，接種于

5、96孔板中。將其分為9組給藥，每組設6個重復孔：(1)正常對照組(NS組)：正常小鼠脾細胞中加入PBS；(2)CIA對照組：CIA小鼠脾細胞中加入PBS；(3)CII(100μg/ml)組：CIA小鼠脾細胞加入CII(終濃度為100μg/ml)；(4)CCK-8(10-8mol/L)組：CIA小鼠脾細胞加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)。(5)CII+CCK-8(10-6mol/L)組：CIA小鼠脾細胞先加入CCK-8(終濃度

6、為10-6mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(6)CII+CCK-8(10-8mol/L)組：CIA小鼠脾細胞先加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(7)CII+CCK-8(10-10mol/L)組：CIA小鼠脾細胞先加入CCK-8(終濃度為10-10mol/L)再加入CII(終濃度為100μg/ml)；(8)CII+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(1

7、0-6mol/L)組：CIA小鼠脾細胞先加入CR1409(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入CII(終濃度為100μg/ml)；(9)CII+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組：CIA小鼠脾細胞先加入CR2945(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)。孵育54小時后加入3H-

8、TdR繼續(xù)孵育18小時用[3H]-TdR摻入法測脾細胞增殖，觀察CCK-8對CIA小鼠脾細胞增殖的影響。 2 取CIA小鼠脾細胞將其分為8組，每組設3個重復孔：(1)對照組：脾細胞中加入PBS；(2)C II(100μg/ml)組：脾細胞中加入C II(100μg/ml)；(3)CCK-8(10-8mol/L)組：在脾細胞中加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)；(4)C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組：在脾細胞中先加入C

9、CK-8(終濃度為10-6mol/L)再加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(5)C Ⅱ+CCK-(10-8mo1/L)組：在脾細胞中先加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)再加入 C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(6)C Ⅱ+CCK-8(10-10mol/L)組：在脾細胞中先加入CCK-8(終濃度為10-10mol/L)，再加入C II(終濃度為1 00μg/m1)； (7)C Ⅱ+CCK-8(1O-8mol/L)+CR

10、 1 409(10-6mol/L)組：在脾細胞中先加入CRl409(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100μg/ml)；(8)C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組：在脾細胞中先加入CR2945(終濃度為10-6mol/L)再加入CCK-8(終濃度為10-8mol/L)最后加入C Ⅱ(終濃度為100pg/ml)。孵育48h后用ELI

11、SA法檢測上述脾細胞上清液中IL-4和IFN-γ的含量觀察CCK-8對CIA小鼠Th1/Th2細胞因子平衡的影響。 結(jié)果： 1.CCK-8對CIA小鼠脾細胞增殖的影響：CIA對照組脾細胞cpm值(10137.02±885.98)較正常對照組(6476.60±595.82)增高(p＜0.05)，C Ⅱ(100μg/ml)組(21732.36±3449.73)較CIA對照組增高(P＜0.01)，單獨CCK-8對脾細胞增殖無明

12、顯作用。CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)組、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)組、CⅡ+CCK-8(10-10 mol/L)組cpm值(9816.75±413.14、10937.11±1332.87、12996.21 ±1 890.65)均較C Ⅱ(100μg/ml)組降低(P＜0.01)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)組、C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(1

13、0-6mol/L)組cpm值(16252.12±2210.41、 15145.39±3084.48)較C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組增高(P＜0.05)。 2 CCK-8對CIA小鼠Th1/Th2細胞因子平衡的影響2.1 CCK-8對Th1型細胞因子IFN-γ的影響：CIA小鼠脾細胞上清液中IFN-γ的濃度：C Ⅱ組(107.96±0.81ng/L)較對照組(60.60±0.98ng/L)升高(P＜0.01)，CCK-8組(

14、58.44 ±8.57ng/L)與對照組相比無明顯作用，C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組、C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組IFN-γ的濃度(86.40±7.1 3ng/L、94.04±3.24ng/L)均較C Ⅱ組降低(P＜0.01)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR 1409(10-6mol/L、)組及C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組IFN-γ的濃度(10

15、1.99±3.20ng/L、102.80±4.43ng/L)較C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)組均升高(P＜0.05)。 2.2 CCK-8對Th2型細胞因子IL-4的影響：CIA小鼠脾細胞上清液中IL-4的濃度：C Ⅱ組(22.41±2.37ng/L)較對照組(25.56 ±2.08ng/L)降低(P＜0.01)，CCK-8組(26.73±1.53ng/L)較對照組無明顯作用，C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組

16、、C Ⅱ+CCK-8(10-6mol/L)組IL-4濃度(36.03±2.37ng/L、27.23±3.79ng/L)均較C Ⅱ組升高(P＜0.05)，C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)組及C Ⅱ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)組IL-4的濃度(23.25±1.82ng/L、23.50±1.27ng/L)較C II+CCK-8(1 0-8mol/L)組均降低