海馬齒狀回星形膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng).pdf

1、神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的主要功能細(xì)胞，它們通過(guò)形成突觸結(jié)構(gòu)，即突觸前末梢和突觸后神經(jīng)元組成的化學(xué)性突觸，執(zhí)行可塑性的突觸信號(hào)傳遞，完成神經(jīng)系統(tǒng)的通訊功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的另一類細(xì)胞，它的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于神經(jīng)元，一直以來(lái)被認(rèn)為僅僅起了支持和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元的作用，是維持神經(jīng)元正常功能活動(dòng)的輔助細(xì)胞。然而近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)支持這些星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了神經(jīng)元的信號(hào)傳遞，主動(dòng)的調(diào)節(jié)突觸傳遞和可塑性。 最近10年來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)

2、的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的突觸傳遞和可塑性調(diào)控的主要途徑之一。 目前已發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)有各種各樣的離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體，如各種鉀通道、鈣通道、甚至鈉通道，以及代謝型的和離子型的谷氨酸受體、γ-氨基丁酸受體等。 然而，最近構(gòu)建成功的GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠使我們可以在紫外光下看到發(fā)出熒光的膠質(zhì)細(xì)胞，為我們的研究提供了有力的工具。 所以，本研究在GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬腦片的齒狀回部位，利

3、用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)穿行傳入纖維刺激產(chǎn)生的電位和電流反應(yīng)，理解膠質(zhì)細(xì)胞不同于神經(jīng)元的電生理學(xué)特征和其中的機(jī)制，以及膠質(zhì)細(xì)胞是否也象神經(jīng)元一樣，對(duì)短串的高頻刺激產(chǎn)生可塑性的改變，進(jìn)一步研究這種膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的機(jī)制以及可能對(duì)神經(jīng)元突觸活動(dòng)的調(diào)控。這對(duì)我們更好的理解神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的學(xué)習(xí)和記憶功能，以及理解神經(jīng)(智能)退行性病變的機(jī)制、進(jìn)展和治療都有重要的意義。 膠質(zhì)細(xì)胞電位的組成成份為了理解上述膠質(zhì)細(xì)胞電位不同于神經(jīng)

4、元突觸后電位的電特性，我們分別使用了膠質(zhì)細(xì)胞膜上受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的特異性阻斷劑，用藥理學(xué)的方法分離了膠質(zhì)細(xì)胞電位的各個(gè)不同組成成份。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞電位能被AMPA/kainate受體特異性的阻斷劑DNQX(10μM)或者是NBQX(20μM)，NMDA受體的特異性阻斷劑APV(50μM)或者是MK-801(30μM)，以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑DHK(300μM)+THA(300μM)所共同抑制。所以我們認(rèn)為，刺激穿行傳入纖維記錄到的膠質(zhì)細(xì)

5、胞電位主要由三部分組成，分別是膠質(zhì)細(xì)胞膜上AMPA/kainate受體介導(dǎo)的、NMDA受體介導(dǎo)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的去極化電位。 膠質(zhì)細(xì)胞NMDA受體亞單位的逆轉(zhuǎn)錄PCR分析目前，功能性的NMDA受體蛋白還沒(méi)有在海馬的膠質(zhì)細(xì)胞上分離到。而如前所述，我們?cè)谀z質(zhì)細(xì)胞上記錄了NMDA受體介導(dǎo)的電流，為了進(jìn)一步證實(shí)在該實(shí)驗(yàn)條件下，NMDA受體在海馬齒狀回的膠質(zhì)細(xì)胞上有表達(dá)，采用了單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NMDA受體亞單位m

6、RNA進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞能轉(zhuǎn)錄NMDA受體的多種亞單位NR1、NR2A和NR2B。 膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象在穿行傳入纖維施加短串的高頻刺激可以誘導(dǎo)顆粒神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。為了闡明相鄰的膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)這種條件刺激是否也能產(chǎn)生可塑性的反應(yīng)，我們?cè)诖┬袀魅肜w維施加相似于誘導(dǎo)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的高頻刺激，結(jié)果在膠質(zhì)細(xì)胞上記錄到了增強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞電位反應(yīng)，而且在高頻刺激后的25-30分鐘，仍然有約300％的增強(qiáng)。說(shuō)明膠質(zhì)細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)出

7、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)反應(yīng)，而且它的增強(qiáng)幅度和成功率都要大于神經(jīng)元。 細(xì)胞外場(chǎng)電位對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響膠質(zhì)細(xì)胞的低跨膜輸入電阻決定了細(xì)胞外的場(chǎng)電位能被膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的電極所記錄，那么是否在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)記錄到的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位是由場(chǎng)電位造成的呢?為此，我們?cè)诩?xì)胞內(nèi)應(yīng)用鉀通道阻斷劑銫離子，縫隙聯(lián)接抑制劑CBX(100μM)，用NMG替代細(xì)胞內(nèi)的鈉離子和鉀離子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞的跨膜輸入電阻升高到了約20MΩ，但它們并不影響膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。另

8、外，采用電壓鉗記錄膠質(zhì)細(xì)胞電流的方法，以減少場(chǎng)電位的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞電流也有長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)反應(yīng)。 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的電流增強(qiáng)不是膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的主要原因海馬齒狀回顆粒神經(jīng)元能被誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，其機(jī)制部分是因?yàn)橥挥|前谷氨酸釋放增加造成了突觸后電位增強(qiáng)，突觸釋放谷氨酸增加也會(huì)引起膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體電流增強(qiáng)。為了闡明是否膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)來(lái)源于增強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體電流，應(yīng)用DHK(150μM)和THA(150μM)阻斷膠質(zhì)細(xì)胞的谷

9、氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)幾乎不受影響。進(jìn)一步在膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)誘導(dǎo)的前后使用離子型谷氨酸受體阻斷劑Kyn，發(fā)現(xiàn)Kyn阻斷了所有的AMPA/kainate受體和NMDA受體后，剩余了轉(zhuǎn)運(yùn)體電流，此電流在高頻刺激后比高頻刺激前增加了約60％，說(shuō)明高頻刺激后，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的活動(dòng)增強(qiáng)了。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，高頻刺激前，轉(zhuǎn)運(yùn)體電流僅占膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)向總電流的11.3±1.9％，而高頻刺激后，這個(gè)比例下降到了6.7±0.6％，說(shuō)明轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)

10、的電位改變?cè)谀z質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位中占了很小的比例。 代謝型谷氨酸受體并未介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)代謝型谷氨酸受體(mGluR)可以幫助誘導(dǎo)或者增強(qiáng)神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，那么膠質(zhì)細(xì)胞膜上的Ⅰ型mGluR是否也參與了膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)呢?應(yīng)用Ⅰ型mGluR的抑制劑AIDA(500μM)，發(fā)現(xiàn)它并不影響膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，說(shuō)明代謝型谷氨酸受體并未介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。應(yīng)用Ⅰ型mGluR的激動(dòng)劑DHPG(30μM)，

11、膠質(zhì)細(xì)胞分化出兩種不同的效應(yīng)，約50％的細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)反應(yīng)減弱；另約50％的細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)反應(yīng)增強(qiáng)。這可能是DHPG同時(shí)激活了Ⅰ型mGluR的兩種亞型受體mGluR1和mGluR5，為此，選用了選擇性的mGluR5受體激動(dòng)劑CHPG(500μM)，結(jié)果它并不影響膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。 膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)與NMDA受體密切相關(guān)為了闡明離子型谷氨酸受體在膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)中的作用，我們使用了離子型谷氨酸受體的阻斷劑Ky

12、n(1.5mM)，發(fā)現(xiàn)Kyn能抑制膠質(zhì)細(xì)胞電位到88.8±3.0％，然后給予高頻刺激，后又立即洗脫Kyn，膠質(zhì)細(xì)胞電位能恢復(fù)到給藥前水平，但沒(méi)有長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。進(jìn)一步應(yīng)用了特異型的AMPA/kainate受體阻斷劑DNQX(10μM)或者NMDA受體阻斷劑APV(50μM)，結(jié)果兩者分別都能抑制膠質(zhì)細(xì)胞電位，但在高頻刺激后洗脫DNQX，膠質(zhì)細(xì)胞電位不僅恢復(fù)，而且出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象，相反，高頻刺激后洗脫APV，僅能恢復(fù)到給藥前水平，而不能誘導(dǎo)

13、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。 膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的關(guān)系在NMDA受體依賴的神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)機(jī)制中，鈣離子通過(guò)開(kāi)放的NMDA受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是誘導(dǎo)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。既然上述結(jié)果提示，膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)需要NMDA受體參與，那么通過(guò)NMDA受體進(jìn)入膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子可能也是誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。為了證明這一假設(shè)，通過(guò)膜片鉗玻璃電極在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)注入鈣離子的螯合劑BAPTA(40mM)，阻斷

14、可能的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高頻刺激誘導(dǎo)后，膠質(zhì)細(xì)胞仍然有長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象，而且與未注入鈣離子螯合劑的正常對(duì)照組相比，并沒(méi)有顯著差別。 膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)與細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的關(guān)系神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)依賴于細(xì)胞內(nèi)一系列的蛋白激酶激活，從而引起突觸后膜上的AMPA受體數(shù)目增加以及單通道電導(dǎo)增加。為了了解膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是否也與一些能調(diào)控長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)相關(guān)的蛋白激酶有關(guān)，我們?cè)谘芯康膯蝹€(gè)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)分別注入了鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ的抑

15、制劑KN93(2mM)，PKA的抑制劑H89(10μM)和PKC的抑制劑chelerythrione(10μM)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均不能阻斷膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。膠質(zhì)細(xì)胞間縫隙聯(lián)接的角色膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)縫隙聯(lián)接連成了一個(gè)巨大的緩沖池，能有效的稀釋所有進(jìn)入膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物。是否這些縫隙聯(lián)接也可能稀釋了注入細(xì)胞內(nèi)的各種蛋白激酶抑制劑和鈣離子螯合劑不得而知。為此，在縫隙聯(lián)接阻斷劑辛醇(300μM)或者CBX(100μM)存在的情況下，同時(shí)

16、細(xì)胞內(nèi)注入40mM的BAPTA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位被顯著的削弱了，然而相應(yīng)的對(duì)照組，只應(yīng)用了辛醇或者CBX，而并未在細(xì)胞內(nèi)注入BAPTA，膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位也被抑制到了相似的程度。說(shuō)明并非是BAPTA螯合了細(xì)胞內(nèi)鈣離子而抑制了膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，而是縫隙聯(lián)接的阻斷劑直接抑制了膠質(zhì)細(xì)胞電位。 結(jié)論1、小鼠海馬齒狀回的星形膠質(zhì)細(xì)胞有不同于神經(jīng)元的電生理學(xué)特性。刺激穿行傳入纖維，能在膠質(zhì)細(xì)胞上記錄到相應(yīng)的刺激誘導(dǎo)

17、的電位。膠質(zhì)細(xì)胞的去極化電位主要由膠質(zhì)細(xì)胞膜上的AMPA/kainate受體、NMDA受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)。 2、海馬齒狀回的膠質(zhì)細(xì)胞在短串高頻刺激后能誘導(dǎo)出長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，這個(gè)增強(qiáng)反應(yīng)并不是細(xì)胞外場(chǎng)電位引起的，也不是增強(qiáng)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體造成的，而主要是由膠質(zhì)細(xì)胞膜上的AMPA/kainate受體介導(dǎo)的。 3、膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)可被NMDA受體阻斷劑所阻斷，但并不能被細(xì)胞內(nèi)的鈣離子螯合劑以及關(guān)鍵激酶的抑制劑所阻斷，其可能的