RDP1258誘導(dǎo)同種異體大鼠腎移植免疫耐受的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的:誘導(dǎo)受體抗原特異性的移植免疫耐受,是維持移植物長期存活的根本性方法之一.近年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn),一種人工合成的HLAⅠ類多肽具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能.研究證實(shí),應(yīng)用HLAB07和B2702分子的75~84區(qū)的不同多肽,在動(dòng)物移植模型中能觀察到非等位基因特異性的免疫抑制作用.但當(dāng)前研究采用的HLAⅠ類衍生肽效果仍不令人滿意,因此優(yōu)化篩選新型HLA衍生肽是該研究領(lǐng)域的突破點(diǎn).另外,HLAⅠ類衍生肽雖然能抑制CTL以及NK細(xì)胞的殺傷活性,但其作

2、用機(jī)理仍不十分清楚.HLA衍生肽的免疫調(diào)節(jié)活性不能夠完全以干擾TCR結(jié)合或影響MHC分子的抗原提呈作用來解釋,因?yàn)镠LA-B07.75-84和HLA-B2702.75-84的作用呈現(xiàn)等位基因非特異性,并且HLA-B2702.75-84的L型及D型均具有延長移植物存活時(shí)間的作用.親和層析法研究表明,HLA衍生肽的作用機(jī)制可能與血紅素氧化酶-1(heme oxygenase -1, HO-1)有關(guān).該研究采用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)理論,在HLA

3、Ⅰ類衍生肽B2702.75-84的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種新型的HLA衍生肽,RDP1258.然后采用人工合成的RDP1258進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),觀測其對人和大鼠T淋巴細(xì)胞毒性的抑制作用.在此基礎(chǔ)上,建立大鼠腎移植模型,觀察RDP1258對移植物的存活時(shí)間、移植腎功能及排斥反應(yīng)的影響.同時(shí),該研究檢測RDP1258對體內(nèi)外HO-1酶活性的作用,探討RDP1258免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的作用機(jī)制.方法:1. 多肽采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案,以ABI43IA型固相多肽

4、合成儀合成,采用RP-HPLC方法純化,分子量鑒定采用質(zhì)譜分析法.RDP1258的氨基酸序列:RNleNleNleRNleNleNleGY;HLA-B2702.75-84的序列:RENLRIALRY.2. 人外周血淋巴細(xì)胞和大鼠脾細(xì)胞采用Ficoll-paque密度梯度離心法獲得.每組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的RDP1258、HLA-B2702.75-84及對照肽.T淋巴細(xì)胞對絲裂原以及同種異體抗原的增殖效應(yīng)采用H<'3>摻入法分析.C

5、TL細(xì)胞以及NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的影響采用H<'3>釋放法分析.3. 各HLA衍生肽采用5mg/kg腹腔注射后,觀察大鼠脾細(xì)胞對由ConA及同種抗原刺激引起的免疫增殖能力的變化趨勢.4. 采用原位移植法將LEWIS大鼠腎移植到F344大鼠體內(nèi),5天后體外結(jié)扎對側(cè)腎臟血供,建立同種異體大鼠腎移植模型.動(dòng)物分組:第1組:不給藥;第2組:給予CsA;第3組:給予RDP1258;第4組:給予RDPl258和小劑量CsA.RDPl258多肽采用腹

6、腔注射(5mg/kg),于術(shù)前7天、術(shù)前1天、術(shù)日、術(shù)后2/周給藥,直至30天;CsA 術(shù)日至術(shù)后5天灌胃(5mg/kg).5. 術(shù)后觀察受體大鼠的存活時(shí)間;監(jiān)測血清肌酐濃度;行彩色多普勒超聲檢查移植腎;術(shù)后7天的移植腎組織行光鏡及電鏡檢查;采用檢測存活超過60天的受體大鼠脾細(xì)胞,對供體以及第三無關(guān)大鼠脾細(xì)胞的MLR的H3摻入率的方法,評價(jià)腎移植受體大鼠免疫耐受狀態(tài).6. HLA衍生肽對HO-1體外活性的影響:大鼠脾組織勻漿內(nèi)膽紅素濃度

7、作為檢測HO-1活性的依據(jù).7. HLA衍生肽對HO-1體內(nèi)活性的影響:大鼠分別接收單劑量的RDP1258、HLA-B2702.75-84、對照肽及對照組(NaCI)注射,各組處理6小時(shí)及12小時(shí)后取脾組織,WESTERN雜交法檢測HO-1蛋白含量;并檢測腎組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)量以及HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平.采用熒光顯微鏡檢測法測定大鼠脾細(xì)胞內(nèi)膽紅素含量.結(jié)果:1. 人工合成的多肽RDPl258純度達(dá)到95.8﹪以上,分子量為122

8、8.8Da,與理論值相符.2. RDPl258對體外培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞以及大鼠脾細(xì)胞的增殖效應(yīng)有較明顯的抑制作用,且對體內(nèi)大鼠脾細(xì)胞免疫增殖功能仍有較強(qiáng)的抑制作用,均較前導(dǎo)肽HLA-B2702.75-84的抑制作用強(qiáng),并呈現(xiàn)出劑量依賴性.RDPl258以及前導(dǎo)肽均能夠顯著抑制人外周血CTL和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng).3. RDP1258聯(lián)合小劑量CSA圍手術(shù)期治療能夠明顯延長移植腎受體大鼠的存活時(shí)間;移植腎功能基本保持穩(wěn)定;超聲檢查提示

9、移植腎血供好,排斥反應(yīng)發(fā)生率低;移植腎病理檢查顯示對照組有嚴(yán)重的排斥反應(yīng)發(fā)生以及組織缺血損傷,而RDP1258聯(lián)合治療組未見明顯的組織損害和排斥反應(yīng)的發(fā)生.MLR培養(yǎng)結(jié)果表明該方法能夠誘導(dǎo)出移植免疫耐受.4. 大鼠脾組織勻漿中加入RDP1258后,HO-1酶活性受到顯著抑制,呈現(xiàn)出劑量依賴性.前導(dǎo)肽HLA-B2702.75-84同樣具有HO-1酶活性抑制作用,但較RDP1258弱.5. 體內(nèi)應(yīng)用RDP1258后,大鼠脾細(xì)胞HO-1活性上

10、調(diào),6小時(shí)提高32﹪,12小時(shí)提高85﹪,與前導(dǎo)肽比較差異顯著.體內(nèi)應(yīng)用RDP1258后,與對照肽比較,大鼠腎組織的HO-1蛋白表達(dá)快速增加,腎組織內(nèi)HO-1 mRNA較對照肽上升明顯,同時(shí)大鼠脾細(xì)胞內(nèi)膽紅素含量與對照肽組相比增加明顯.結(jié)論:1. 通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),優(yōu)化篩選并合成出新型的HLA衍生肽,RDP1258.在固相多肽合成儀上采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成RDP1258,其純度達(dá)95﹪以上,分子量為1228.8Da,與理論值相符.2

11、. RDP1258具備了較前導(dǎo)肽HLA-B2702.75-84更強(qiáng)的體內(nèi)外抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用,并對CTL及NK的細(xì)胞毒性有較強(qiáng)的抑制效應(yīng).3. 采用大鼠腎移植模型試驗(yàn),RDP1258聯(lián)合小劑量CSA能夠明顯延長受體大鼠的存活時(shí)間,并誘導(dǎo)出移植免疫耐受.4. RDP1258對HO-1具有較強(qiáng)的體外酶活性抑制作用,呈劑量依賴性.體內(nèi)應(yīng)用RDP1258后,能夠明顯上調(diào)大鼠脾細(xì)胞HO-1活性,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)膽紅素濃度迅速提升.并發(fā)現(xiàn)其可能通過促