呼吸道合胞病毒感染巨噬細胞活化Toll樣受體3、Toll樣受體7介導的抗病毒作用研究.pdf

1、目的：探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染巨噬細胞（RAW264.7細胞）后，Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）及Toll樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR7）的水平變化，初步研究TLR3和TLR7活化在RSV感染中介導產(chǎn)生的I型干擾素（interferon，IFN）抗病毒作用及其可能的調(diào)控機制，為臨床RSV感染的預防與治療上

2、提供新的思路。
　　 方法：RSV感染體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞，預先分組給予TLR3或TLR7特異性抗體處理，分別于不同時間點（4h、8h、12h、16h和24h）收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清，并以未感染病毒的細胞為對照組。①用Trizol提取細胞總RNA，半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測TLR3、TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）、

3、干擾素調(diào)節(jié)因子7（Interferon regulatory factor 7，IRF7）、干擾素α（IFN-α），干擾素β（IFN-β），RSV融合蛋白基因（F基因）的mRNA表達量變化；②用免疫印跡（western blot）法檢測TLR3及TLR7蛋白的表達變化；③用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-α、IFN-β的表達變化；④用MTT四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測各組細胞存活率及病毒抑制率變化；⑤空斑形成實驗（p

4、laque forming unit，PFU）測定各組不同時間點的病毒復制滴度。
　　 結果：①在mRNA轉錄水平，感染組上調(diào)TLR3、TLR7、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β、RSV F基因；在給予TLR3抗體組，雖上調(diào)TLR3、IRF3、IFN-α、IFN-β的表達，但表達量都比感染組同時間點下降，且下降有統(tǒng)計學意義，TLR7、IRF7、RSV F基因較RSV感染組升高；在給予TLR7抗體組，雖上調(diào)TLR7、IR

5、F7、IFN-α、IFN-β的表達，但表達量都比感染組同時間點下降，且下降有統(tǒng)計學意義，TLR3、IRF3、RSV F基因較RSV感染組升高；②在蛋白水平，感染組上調(diào)TLR3、TLR7蛋白的表達；在給予TLR3抗體組，未檢測到特異性蛋白條帶；在給予TLR7抗體組，TLR7蛋白表達量比感染組同時間點顯著下降；③RSV感染RAW264.7細胞后，上調(diào)細胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量；給予TLR3抗體組，細胞培養(yǎng)上清中IFN-α和

6、IFN-β的分泌量也隨感染時間的延長而含量增加，但IFN-β較RSV感染組顯著降低；給予TLR7抗體組，細胞培養(yǎng)上清中IFN-α和IFN-β的分泌量也隨感染時間的延長而含量增加，但IFN-α較RSV感染組顯著降低；④給予TLR3抗體組及給予TLR7抗體組，細胞存活率均較RSV感染組下降，給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒抑制率均有統(tǒng)計學差異；⑤RSV感染RAW264.7細胞后，病毒隨時間的延長上調(diào)復制滴度；給予TLR3抗體組與給

7、予TLR7抗體組的病毒復制滴度都較感染組高，且給予TLR3抗體組較給予TLR7抗體組病毒復制滴度更高。
　　 結論：RSV感染RAW264.7巨噬細胞后可上調(diào)TLR3、TLR7表達，其活化后介導產(chǎn)生的I型干擾素在一定程度上可抑制病毒的增殖水平，通過分別抑制TLR3及TLR7后，I型干擾素含量及細胞存活率的降低，RSV F基因及病毒滴度的上調(diào)，都說明了RSV感染中IFN引起的抗病毒免疫機制與TLR3及TLR7的轉導途徑有關，并且以