鬼臼毒素衍生物Z-26-2抗多藥耐藥腫瘤細(xì)胞作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討由實(shí)驗(yàn)室合成的鬼臼毒素衍生物Z-26-2誘導(dǎo)人源多藥耐藥腫瘤細(xì)胞K562/A02凋亡在體外的作用效果及機(jī)制,為抗腫瘤藥物研制提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1 MTT法和SRB法檢測Z-26-2對各種腫瘤細(xì)胞增殖/抑制作用。
　　 用96孔培養(yǎng)板接種對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,加入不同濃度Z-26-2(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L),48h后以MTT

2、法和SRB法測定Z-26-2在體外對多種腫瘤細(xì)胞的IC50或G150值。用SRB法檢測鬼臼毒素新衍生物對K562/A02細(xì)胞生長曲線的影響。
　　 2光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡觀察Z-26-2作用后K562/A02細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。
　　 在對數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞中加入不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L),作用于K562/A02細(xì)胞24h,Giemsa染色后光學(xué)顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。同法進(jìn)行H

3、oechst33342熒光染色,以紫外光(340nm)激發(fā)Hoechst,熒光顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。
　　 3瓊脂糖凝膠電泳分析Z-26-2對K562/A02細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響。
　　 在對數(shù)生長期KBV200細(xì)胞,加入不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用24h后抽提樣本DNA,于1.5％瓊脂糖膠電泳,電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)照相。VP-16(10μmol/L)為陽性對照。
　　

4、 4流式細(xì)胞術(shù)分析Z-26-2對K562/A02細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響。
　　 對數(shù)生長期K562/A02細(xì)胞,加入不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)藥物,分別作用12 h、24 h后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率以其及對細(xì)胞生長周期的影響。
　　 5 RT-PCR法檢測不同濃度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)對K562/A02細(xì)胞mdr-1、p53、p21、caspase-3 mRNA表

5、達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1 Z-26-2的體外抗腫瘤作用。
　　 本課題通過MTT和SRB法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Z-26-2對多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用。IC50范圍在0.68μmol/L～15μmol/L之間,對skov3的作用最明顯,IC50值達(dá)到0.68μmol/L。
　　 從SRB結(jié)果可看出:Z-26-2對人紅白血病細(xì)胞(K562)及阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥株(K562/A02)均有抑制作用,其GI5

6、0分別為1.4μmol/L、1.6μmol/L,對多藥耐藥細(xì)胞及其母本細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 通過繪制藥物作用K562/A02細(xì)胞6天的生長曲線,發(fā)現(xiàn)不同濃度的Z-26-2對K562/A02細(xì)胞的生長抑制作用顯著,且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。
　　 2鬼臼毒素衍生物Z-26-2不同濃度組對K562/A02細(xì)胞周期的影響
　　 本文采用流式細(xì)胞儀分別檢測不同濃度組的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作

7、用12h和24h后對K562/A02細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示與空白對照組相比較,不同濃度的Z-26-2在12h、24h時(shí)間點(diǎn)都可將細(xì)胞周期阻斷在S期。這說明Z-26-2作用12h、24h后,藥物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),并將細(xì)胞阻滯于DNA合成期。
　　 3檢測鬼臼毒素衍生物Z-26-2誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞的凋亡的效果
　　 把不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02細(xì)胞24h后,分別用Gi

8、emsa染液和熒光染料Hoechst33342/PI對細(xì)胞進(jìn)行染色,前者將細(xì)胞核染成粉紅色,胞漿染成藍(lán)紫色。未加藥組的細(xì)胞核染色均一、結(jié)構(gòu)完整、核漿比值大；給藥組細(xì)胞可見細(xì)胞核形態(tài)呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征:核膜皺縮,核固縮,核碎裂。用熒光染料Hoechst33342對細(xì)胞進(jìn)行染色,在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)色熒光,熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)K562/A02細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂,細(xì)胞膜不斷出芽、脫落,細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的凋

9、亡小體,伴隨著Z-26-2濃度的加大,鏡下具有這種細(xì)胞形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量愈加明顯,凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。并且鬼臼毒素新衍生物濃度的越高,細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化愈顯著,凋亡細(xì)胞的比例愈多,顯示出明顯的劑量依賴性。在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度的Z-26-2分別作用于KBv200細(xì)胞24h,提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,可呈現(xiàn)典型的“DNA梯子樣”圖譜。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行腫瘤細(xì)胞凋亡率測定,可見經(jīng)不同濃度的Z-26-2(μmol

10、/L、2μmol/L)作用于K562/A02細(xì)胞24h后,于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群,稱為“A0細(xì)胞群”或“亞G1細(xì)胞群,Sub-G1”即凋亡細(xì)胞群,該現(xiàn)象被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志之一,且凋亡細(xì)胞的比例隨著鬼臼毒素新衍生物濃度的升高而增大,呈一定的劑量依賴性。綜上結(jié)果可以認(rèn)為鬼臼毒素新衍生物高濃度作用于K562/A02細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　 4 Z-26-2對K562/A02細(xì)胞多藥耐藥性基因mdr

11、-1、凋亡相關(guān)基因p53、p21、caspase-3表達(dá)
　　 本實(shí)驗(yàn)觀察了Z-26-2對mdr-1基因及凋亡相關(guān)基因p53、p21和caspase-3的mRNA表達(dá)的影響。經(jīng)不同濃度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02細(xì)胞24小時(shí),RT-PCR結(jié)果顯示Z-26-2可增加p53、p21、caspase3的mRNA表達(dá),同時(shí)降低了mdr-1mRNA的表達(dá),結(jié)果同對照組相比均有顯著性差異(P<0.0

12、5),且呈一定的劑量依賴性。提示Z-26-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用極可能依靠上調(diào)了p53、p21、caspase-3表達(dá),同時(shí)下調(diào)多藥耐藥性基因mdr-1 mRNA的表達(dá),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論:鬼臼毒素衍生物Z-26-2的結(jié)構(gòu)是實(shí)驗(yàn)室首次合成,并通過實(shí)驗(yàn)室體外實(shí)驗(yàn),證明了其具有顯著的體外抑制多種人源性腫瘤細(xì)胞生長的特性,對多藥耐藥腫瘤細(xì)胞抑制作用也同樣顯著,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷,其主要是將腫瘤細(xì)胞生長周期阻斷在S期,能