鬼臼毒素衍生物CWH-2誘導(dǎo)多耐藥細(xì)胞標(biāo)K562-A02凋亡及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:本文研究新型鬼臼類衍生物CWH-2對(duì)K562/A02細(xì)胞抗多藥耐藥作用，探究其作用機(jī)制，為鬼臼毒素衍生物結(jié)構(gòu)優(yōu)化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、MTT法檢測(cè)CWH-2體外抗腫瘤活性。
　　MTT法檢測(cè)正常細(xì)胞(Hacat、FB)及多種腫瘤細(xì)胞(A549、Hela、SKOV3、SH-SY5Y、MCF-7、HepG-2、K562、K562/A02)的IC50值，分析CWH-2對(duì)K562/A02細(xì)胞的耐藥程度并繪制

2、K562及K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　2、Giemsa染色法及Hoechst33342熒光染色法觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，初步探討CWH-2促凋亡作用及其機(jī)制。
　　3、瓊脂糖凝膠電泳法分析CWH-2誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞DNA斷裂的變化。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)分析不同劑量CWH-2對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞周期及凋亡率的影響。
　　5、RT-PCR檢測(cè)VP-16和不同濃度CWH-2對(duì)K562及K562

3、/A02細(xì)胞mdr-1、p53、Bax、caspase-3、PCNA、TopoⅡαmRNA表達(dá)的影響。
　　6、通過(guò)抑瘤率的計(jì)算研究不同劑量CWH-2治療動(dòng)物移植腫瘤模型的效果。
　　結(jié)果:
　　1、WH-2體外抗腫瘤的活性
　　通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CWH-2體外抗多種腫瘤細(xì)胞效果顯著，IC50值的范圍在0.39～8.63μmol/L之間，明顯高于已經(jīng)上市的臨床抗腫瘤藥物VP-16（3.74～67.44μmol/

4、L）的抗腫瘤活性。通過(guò)對(duì)親本白血病細(xì)胞株和其耐藥株的測(cè)定，CWH-2顯示出抗多藥耐藥的潛能。CWH-2對(duì)人源正常細(xì)胞Hacat和Fb的殺傷作用明顯減弱，其IC50分別為224.38±3.83μmol/L和60.93±1.05μmol/L，說(shuō)明CWH-2對(duì)細(xì)胞的殺傷具有一定的特異甄別性。 MTT結(jié)果顯示:耐藥株K562/A02對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)為41.14(親本K562細(xì)胞IC50=0.53±0.04μmol/L;其耐藥株K562/A02

5、細(xì)胞IC50=21.81±0.92μmol/L)，而通過(guò)對(duì)不同濃度CWH-2作用于K562和K562/A02后繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示:相同藥物濃度的CWH-2和VP-16對(duì)同種細(xì)胞的抑制程度有明顯差異，CWH-2具有起效快，藥效持續(xù)，且具有劑量依賴性特點(diǎn)。
　　2、CWH-2體內(nèi)抗腫瘤作用
　　將CWH-2（20mg/kg/d、30mg/kg/d）連續(xù)腹腔注射6天，S180鼠肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)抑制率（58.39％和64.48

6、％）與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)，體重比陰性對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VP-16組抑瘤率為72.63％，死亡率明顯高于其它組，且體重比與陰性對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.01)。結(jié)果說(shuō)明:CWH-2在體內(nèi)抑制腫瘤作用明顯，且毒性小于VP-16。
　　3、CWH-2誘導(dǎo)耐藥株細(xì)胞凋亡的研究
　　不同濃度CWH-2（3，8，12μmol/L）作用K562/A02細(xì)胞24h后，光學(xué)顯微鏡(10×)下顯示

7、:隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞碎裂的程度增大，且藥效較VP-16明顯。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn):未加藥組的腫瘤細(xì)胞染色均勻，形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整;給藥組則出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核皺縮現(xiàn)象，隨著濃度增加細(xì)胞膜破碎，并在高濃度組出現(xiàn)細(xì)胞核固縮成均一致密物，進(jìn)而發(fā)生分裂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變，形成大小不一的凋亡小體排出膜外。在熒光顯微鏡下觀察凋亡的特征更加突出，發(fā)生裂變的細(xì)胞呈亮藍(lán)色，高濃度組的凋亡小體數(shù)量最多。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)藥物作用后的

8、細(xì)胞，其核小體已斷裂形成DNA片斷，經(jīng)過(guò)提取和純化后在凝膠電泳上產(chǎn)生n條帶，形成了典型的“DNA iadder”圖譜。分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞凋亡率的結(jié)果，從整體來(lái)看，無(wú)論是24h，還是時(shí)間達(dá)至48h，細(xì)胞的凋亡率隨藥物劑量的增大而增大，且濃度越高增漲幅度越大。并且，從凋亡率來(lái)看，在48h時(shí)三種劑量的CWH-2均高于VP-16。K562/A02細(xì)胞在藥物CWH-2作用下的凋亡率具有時(shí)間及劑量依賴性的特點(diǎn)。
　　以上從形態(tài)

9、學(xué)、瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)CWH-2對(duì)白血病耐藥株K562/A02具有促使其凋亡的作用。
　　4、CWH-2對(duì)白血病耐藥株K562/A02生長(zhǎng)周期的影響
　　不同濃度CWH-2（3，8，12μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞24h、48h，結(jié)果顯示:24h和48h細(xì)胞周期被阻斷于S期。
　　5、CWH-2對(duì)K562/A02和（或）K562多種基因mdr-1、TopoⅡα，p53、Bax、

10、caspase-3、PCNA的mRNA表達(dá)影響。
　　不同濃度CWH-2(K562:2，4，8μmol/L; K562/A02:3，8，12μmol/L)作用于K562和（或）K562/A02細(xì)胞24小時(shí)后，RT-PCR結(jié)果顯示:CWH-2可下調(diào)K562細(xì)胞PCNA mRNA的表達(dá)，上調(diào)p53、Bax、caspase-3、TopoⅡαmRNA的表達(dá);CWH-2可下調(diào)K562/A02細(xì)胞mdr-1、PCNA mRNA的表達(dá)，上調(diào)p5

11、3、Bax、caspase-3、TopoⅡαmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:CWH-2對(duì)多種人源腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)及殺傷作用，尤其是對(duì)具有多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞具有抗耐藥性的特點(diǎn)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示:CWH-2較陽(yáng)性對(duì)照藥VP-16的抗腫瘤活性更強(qiáng)，并且影響K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，增加其凋亡率;體內(nèi)S180動(dòng)物瘤體實(shí)驗(yàn)顯示:雖然CWH-2與VP-16的抑瘤效果相當(dāng)，但毒性明顯降低。探索其分子機(jī)制，可能與多種基因相關(guān):1.參與p5