鵝Ⅲ型干擾素及其受體的鑒定、組織表達(dá)與免疫學(xué)特性研究.pdf

1、干擾素(IFNs)是病原微生物入侵，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一類具有抗病毒活性的細(xì)胞因子，屬機(jī)體Ⅱ類細(xì)胞因子，在先天免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。目前，根據(jù)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及受體特性等，將干擾素分為Ⅲ類:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素。Ⅲ型干擾素（IFN-λs）為2003年發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，其抗病毒作用并不是直接殺傷病毒，而是通過與其特異受體IFNLR1和IL-10R2構(gòu)成的異源二聚體復(fù)合物結(jié)合，激活與Ⅰ型干擾素相似的JAK-STAT信號(hào)通路，

2、誘導(dǎo)一系列具有抗病毒作用的干擾素刺激基因(ISGs)。
　　本研究首次克隆獲得鵝Ⅲ型干擾素(goIFNL)及其特異受體(goIFNLR1)的cDNA序列，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。goIFNL的cDNA序列獲得823 bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼189 aa; goIFNLR1序列獲得1952bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼512 aa。通過NJ法進(jìn)化樹分析，顯示這兩個(gè)基因?qū)儆邙B類這一分支，與禽類親緣關(guān)系更為接近。<

3、br>　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)goIFNL和goIFNLR1的組織分布情況進(jìn)行探索，結(jié)果顯示goIFNL主要分布在呼吸道組織肺臟(LU)、氣管(TR);胃腸道組織小腸(SI)、肌胃(GI);皮膚(SK);胰腺(P)及全血(Blood)等上皮細(xì)胞豐盛的組織中，其特異受體goIFNLR1具有相似的組織分布情況。
　　為了解goIFNL的免疫學(xué)特性，選用四種TLR的激動(dòng)劑及三種禽類相關(guān)病毒分別刺激鵝外周血單核細(xì)胞建立體外感染細(xì)胞

4、模型，結(jié)果顯示在TLR3的激動(dòng)劑Poly(I∶C)以及TLR9的激動(dòng)劑ODN2006的刺激下，goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平得到顯著性的提升。在TLR4的激動(dòng)劑LPS及TLR7的激動(dòng)劑R848的刺激下，goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對(duì)照組無顯著性差異。goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這四種TLR的激動(dòng)劑的刺激下相較對(duì)照組均無顯著性差異。緊接著，我們又探究了鵝重要傳染病的病毒病原對(duì)目標(biāo)分子的影響:在小鵝瘟(GPV)病毒的感染

5、下，goIFNL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著性的升高;在低致病性禽流感病毒(H9N2 AIV)及鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的感染下，goIFNLmRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對(duì)照組無顯著性差異，而goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在這三種病毒的刺激下均無顯著性差異。同時(shí)，選用這三種禽類病毒人工感染雛鵝建立體內(nèi)動(dòng)物模型，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)goIFNL及goIFNLRI mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示在H9N2 AIV的感染下，goIFNL的表達(dá)

6、量相較對(duì)照組在肺臟組織(LU)中有近20倍的提升，存胰腺組織(P)中有近40倍的提升。而在其他兩種病毒的感染下，goIFNL及goIFNLR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較對(duì)照組無顯著性差異。以上結(jié)果表明goIFNL在鵝的抗病毒固有免疫中扮演著一定的角色。
　　為進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能，選擇對(duì)goIFNL進(jìn)行原核和真核表達(dá)，分別構(gòu)建pET-32α-goIFNL原核表達(dá)載體及pcDNA3.1-goIFNL真核表達(dá)載體。構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒以

7、IPTG終濃度0.8mM誘導(dǎo)3h的條件在大腸桿菌BL21(DE3)中被成功誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在。利用Ni-NTA親和層析純化重組goIFNL融合蛋白，并以此為免疫原制備鼠抗goIFNL多克隆抗體。經(jīng)Western-Blot驗(yàn)證，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-goIFNL能在BHK21細(xì)胞中表達(dá)goIFNL蛋白，這為goIFNL抗病毒免疫學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上，本研究成功克隆了goIFNL及goI