慢病毒介導(dǎo)MicroRNA抑制膠質(zhì)瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建mir-7-3基因慢病毒表達載體，為進一步研究mir-7-3基因的功能及其在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。觀察慢病毒介導(dǎo)MicroRNA對膠質(zhì)瘤細胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)技術(shù)從含有mir-7-3基因的質(zhì)粒pENTR-MIRRNA VECTOR擴增目的基因mir-7-3，并將基因克隆到慢病毒載體表達質(zhì)粒Lt-GFP-RNAi VECTOR[含增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因]中，

2、構(gòu)建慢病毒載體表達質(zhì)粒Lt-GFP-mir-7-3，酶切、測序驗證mir-7-3基因后，將Lt-GFP-mir-7-3質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細胞系293T細胞，獲得攜帶mir-7-3基因和EGFP基因的重組慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3，取濃縮純化后的病毒上清感染293T細胞和人膠質(zhì)瘤細胞U251，熒光顯微鏡觀察293T細胞的熒光表達，RT-PCR鑒定U251

3、細胞中mir-7-3基因的表達水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot法檢測腫瘤細胞內(nèi)源性EGFR、AKTmRNA及蛋白表達水平，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖活性和增殖周期。
　　 結(jié)果：Lt-GFP-mir-7-3共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T能產(chǎn)生高濃度的重組慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3，熒光顯微鏡下能直接觀察EGFP，F(xiàn)IV-CMV-EGFP-mir-7-3中