rmFⅦ-Gen復(fù)合物靶向TF治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文rmFⅦGen復(fù)合物靶向TF治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊崢嶸申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：程天民20040501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文8組表達(dá)在保留重組蛋白TF結(jié)合活性破壞促凝血活性的基礎(chǔ)上將其與Genistein交聯(lián)構(gòu)建一種新的復(fù)合物嘗試從抑制TF的促凝活性及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)雙方面入手并利用靶向蛋白提高Genistein局部藥物濃度充分發(fā)揮其多重抑瘤效果抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移本研究內(nèi)容

2、主要分三個部分rmFpPIC9K酵母表達(dá)載體的構(gòu)建通過RTPCR方法從小鼠肝臟組織獲得mFcDNA全長并對其進(jìn)行定點(diǎn)突變測序正確后再用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出所需目的片段NotEcoR雙酶切pPIC9K質(zhì)粒及目的片段后分別鋪膠回收連接過夜所構(gòu)建載體均轉(zhuǎn)化大腸桿菌快速抽提陽性質(zhì)粒DNA酶切及測序鑒定rmF蛋白的畢赤酵母表達(dá)純化及活性初步鑒定構(gòu)建載體以電穿孔法轉(zhuǎn)染酵母菌GS115在山梨醇選擇平板(HIS)上挑取陽性克隆依次進(jìn)行PCR鑒定G418

3、篩選Mut篩選及小量搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)尋找高拷貝菌株與表達(dá)蛋白的最佳收獲時段篩選結(jié)束后大量搖菌于最佳時段收獲上清液經(jīng)超濾濃縮透析脫鹽親和層析純化后將所收集樣品冷凍抽干備用純化蛋白用SDSPAGEWesternBlot鑒定并用凝血實(shí)驗(yàn)和免疫組化法檢測其生理活性rmF與Genistein的交聯(lián)及交聯(lián)產(chǎn)物抗癌活性研究將rmF與Genistein用紫外交聯(lián)純化后取小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16人乳腺癌細(xì)胞MCF7通過MTT比色法分析交聯(lián)產(chǎn)物對細(xì)胞增殖的影響制

4、作裸鼠皮下移植瘤和實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型研究交聯(lián)產(chǎn)物對腫瘤生長新生血管形成以及血行轉(zhuǎn)移的影響獲得以下主要結(jié)果1.從小鼠肝臟成功擴(kuò)增出mFcDNA開放閱讀框架全長序列測序結(jié)果與Genbank資料(編號AK089402)對應(yīng)序列完全相同并對上述序列進(jìn)行3個氨基酸的定點(diǎn)突變(P10QK32EK341A)測序證實(shí)與設(shè)計(jì)位點(diǎn)完全一致2.從mF正常及突變?nèi)L序列PCR擴(kuò)增出3個目的片段酶切連接后構(gòu)建了3種rmFpPIC9K酵母表達(dá)載體(M1mF輕鏈pPI