葉酸-殼聚糖siRNA納米復(fù)合物抗腫瘤細(xì)胞乙酰肝素酶的靶向性研究.pdf

1、目的：根據(jù)人乙酰肝素酶(heparanase，HPA)的基因序列(cDNA)設(shè)計合成并篩選出有效的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。用siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，檢測乙酰肝素酶的表達(dá)情況，以篩選出能夠有效干擾乙酰肝素酶mRNA及蛋白表達(dá)的siRNA片段。通過侵襲轉(zhuǎn)移實驗來檢測siRNA的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，為研發(fā)抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物提供理論基礎(chǔ)。另外，以殼聚糖為材料包裹siRNA，并偶聯(lián)特異性

2、的腫瘤細(xì)胞靶向分子葉酸，通過葉酸與細(xì)胞表面葉酸受體結(jié)合，提高siRNA的輸送效率，實現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。
　　 方法：委托上海吉碼制藥技術(shù)有限公司合成siRNA片段。用lipo2000包裹不同濃度的帶有熒光標(biāo)記的FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，檢測其轉(zhuǎn)染效率。把實驗分為6組，實驗重復(fù)3次。①陽性對照組(Positive control orβ-actin，PC)；②陰性對照組(Negative control，NC

3、)；③siRNA片段Ⅰ；④siRNA片段Ⅱ；⑤siRNA片段Ⅲ；⑥control組。以lipo2000為載體，采用瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，通過RT-PCR和Western Blot篩選出有效干擾乙酰肝素酶的mRNA及蛋白表達(dá)的siRNA片段。通過MTT法分別檢測轉(zhuǎn)染了24h、48h和72h后的MCF-7細(xì)胞的增殖情況。葉酸偶聯(lián)殼聚糖，通過制備的葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應(yīng)，獲得葉酸偶聯(lián)殼聚糖(FA-CS)；采用紅外光譜法驗證偶聯(lián)

4、是否成功，紫外分光光度法測定偶聯(lián)比。然后用偶聯(lián)了葉酸的殼聚糖與siRNA制備成FA-CS-siRNA納米復(fù)合物。測定納米復(fù)合物粒徑和形態(tài)及其包封率。轉(zhuǎn)染：分別以control組、FA-CS組、FA-CS-siRNA納米復(fù)合物組、CS-siRNA組和lipo2000-siRNA組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于48h提取總RNA通過RT-PCR檢測其mRNA表達(dá)情況，于72h提取蛋白質(zhì)通過Western Blot檢測其乙酰肝素酶表達(dá)情況。腫瘤細(xì)胞侵襲實驗分成

5、lipo2000-siRNA組，F(xiàn)A-CS-siRNA納米復(fù)合物組和陰性對照組。把轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)了24h的細(xì)胞接種于鋪了Matrigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)小池中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜情況，染色并計數(shù)。
　　 結(jié)果：⑴不同濃度的FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)FAM-siRNA濃度為80nM/L和100nM/L時，轉(zhuǎn)染效率比較高。⑵3個siRNA片段都不同程度地下調(diào)乙酰肝素酶mRNA的表達(dá)

6、，其中siRNA片段Ⅰ效果最明顯。⑶紅外光譜確認(rèn)葉酸已成功與殼聚糖偶聯(lián)。⑷FA-CS-siRNA納米復(fù)合物的粒徑為197.7nm，形態(tài)為圓型，分布較均勻。⑸FA-CS-siRNA納米復(fù)合物組能有效地干擾MCF-7細(xì)胞中乙酰肝素酶的表達(dá)。其干擾效率高于CS-siRNA組，接近于lipo2000-siRNA組。⑹腫瘤細(xì)胞侵襲實驗顯示lipo2000-siRNA組和FA-CS-siRNA納米復(fù)合物能有效抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

7、　　 結(jié)論：①不同濃度組FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞顯示，80nM/L和100nM/L這兩個濃度的轉(zhuǎn)染效率比較好且結(jié)果很接近。因此后續(xù)實驗采用80nM/L的siRNA作為轉(zhuǎn)染濃度。②siRNA片段Ⅰ能有效干擾MCF-7細(xì)胞乙酰肝素酶的表達(dá)，并有效地抑制了MCF-7細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此選擇siRNA片段Ⅰ用于后續(xù)實驗。③制備了粒徑較小的FA-CS-siRNA納米復(fù)合物，并可做為siRNA的傳遞載體有效轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。④FA