活體轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒對糖尿病小鼠腎臟的保護作用及其機制.pdf

1、目的：糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，如不積極治療將有10％發(fā)展至終末期腎衰竭。目前，糖尿病腎病的治療僅限于控制血糖、血壓和蛋白尿等，尚缺乏理想的防治方法，因此尋找糖尿病腎病的理想防治靶點是當(dāng)今腎臟病研究的熱點之一。研究表明一系列與生長發(fā)育相關(guān)的因子在糖尿病腎病發(fā)病中重新活躍，呈現(xiàn)高表達，并與腎臟的病理改變程度密切相關(guān)，推測可能參與糖尿病腎病的病理生理過程，并有可能成為糖尿病腎病防治的新靶點。本試驗擬以發(fā)育相關(guān)因子Gremlin作

2、為靶點，STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，觀察轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒對糖尿病小鼠腎臟病理學(xué)變化、腎臟細胞增殖凋亡情況、腎功能及BMP7表達等的影響，探討抑制Gremlin表達后對腎臟的可能保護作用。同時，高糖刺激體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞，觀察轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒對細胞增殖、細胞外基質(zhì)的分泌以及細胞內(nèi)Gremlin、BMP7、TGF-β、MMP2和磷酸化Smad5等因子表達的影響，揭示Gremlin表達抑制后對腎臟保護作用

3、的可能機制。
　　 方法：動物實驗部分：選擇12周齡健康的雄性CD1小鼠54只，隨機分為3組，正常對照組（N）、糖尿病轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（STZ）、糖尿病轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒組（Gremlin-si）（每組18只）。水合氯醛腹腔注射麻醉下行單腎切除術(shù)，術(shù)后兩周STZ及Gremlin-si組小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素（STZ）150mg/kg，對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72h后確定是否成模。成模當(dāng)天Gremli

4、n-si組小鼠尾靜脈快速注射gremlin siRNA質(zhì)粒和要求劑量的轉(zhuǎn)染載體，'STZ組用同樣方法注射對照質(zhì)粒，此后每隔7天注射一次。分別于成模后1周、2周及12周每組取6只小鼠處死，收集小鼠24小時尿液和血標(biāo)本，測尿蛋白、肌酐，血糖、血肌酐；取部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，同時制備2-4μm厚切片，光鏡HE、PAS染色觀察腎臟病理改變，免疫組化觀察Gremlin、PCNA和Ⅳ型膠原的表達，同時應(yīng)用免疫雙染技術(shù)觀察PCNA

5、和Gremlin的表達及Gremlin與細胞增殖的關(guān)系，TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測晚期糖尿病小鼠腎臟細胞凋亡情況，Western blotting檢測Gremlin、BMP7的表達。細胞實驗部分：將小鼠系膜細胞（MMCs）分成4組：正常糖組（NG）；高糖刺激組（HG）；高糖刺激轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組（HG+V）和高糖刺激轉(zhuǎn)gremlin siRNA質(zhì)粒組（gremlin-si）。細胞培養(yǎng)至80％融合時傳代至6孔板和8孔腔室玻片，用不含有抗生素的D

6、MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，改用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基同步化12小時，然后用Lipofectmin2000將gremlin siRNA質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對應(yīng)組。培養(yǎng)24小時后，HG、HG+V和gremlin－si組用高糖培養(yǎng)基（含葡萄糖30mmol/L）培養(yǎng)，NG組用含葡萄糖5.5mmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于高糖刺激后6h、12h、24h和48h收集細胞，檢測培養(yǎng)基內(nèi)Ⅳ型膠原表達；細胞免疫組化檢測Gremlin和PCNA表達，觀察

7、細胞增殖情況；免疫共沉淀驗證Gremlin與BMP7的相互作用；Western blot檢測Gremlin、BMP7、TGF－β、MMP2及磷酸化Smad5等的表達情況。結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用多重比較的方差分析，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：動物實驗部分：轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒有效抑制了Gremlin在糖尿病

8、小鼠腎臟的表達。轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒后腎小球和腎小管的直徑均較STZ組減小，并接近正常水平，STZ組和gremlin-si組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫雙染結(jié)果顯示Gremlin與PCNA同時強表達于同一細胞，說明Gremlin和細胞增殖有一定關(guān)系。免疫組化PCNA染色顯示，STZ組細胞增殖明顯高于N組，給予gremlin siRNA質(zhì)粒后，PCNA染色明顯減少，說明抑制Gremlin表達可以抑制糖尿病早期腎臟細胞的增殖。TUN

9、EL同樣顯示給予gremlin siRNA質(zhì)粒后，顯著地抑制了晚期糖尿病小鼠腎臟細胞凋亡。STZ組BMP7表達在第1和第2周輕度增高，而在第12周顯著下降，轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒后使BMP7的表達接近N組，且STZ組和gremlin-si組差異顯著。細胞實驗部分：Gremlin蛋白在HG組和HG+V組各時間點表達均強于N組，HG+gremlin-si組較HG+V組Gremlin表達受到抑制，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫細胞化

10、學(xué)結(jié)果顯示：HG組和HG+V組PCNA陽性細胞較N組明顯增多，而轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒后，HG+gremlin-si組較HG+V組PCNA陽性細胞有所減少（p<0.05），說明轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒抑制了高糖刺激小鼠系膜細胞的增殖。細胞培養(yǎng)基內(nèi)Ⅳ型膠原的分泌水平在轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒后明顯下降，并且HG+gremlin-si組較HG+V組MMP2的表達回升，Ⅳ型膠原的分泌水平在轉(zhuǎn)染后下降可能與MMP

11、2表達回升使細胞外基質(zhì)降解有關(guān)。免疫共沉淀結(jié)果顯示BMP7與Gremlin存在相互作用，同時我們觀察到高糖刺激的小鼠系膜細胞Gremlin表達在6-48h持續(xù)升高；BMP7在高糖刺激早期6h和12h表達輕度增高，24h以后表達顯著下降；磷酸化smad5在高糖刺激24h以后也明顯下降。轉(zhuǎn)染gremlin siRNA質(zhì)粒后，即HG+gremlin-si組較HG+V組48h Gremlin表達受到抑制，而BMP7和磷酸化smad5表達恢復(fù)，且

12、兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。TGF-β在HG組和HG+V組均表達強于N組，而轉(zhuǎn)染抑制了TGF-β在高糖刺激小鼠系膜細胞內(nèi)的表達。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染Gremlin si-RNA質(zhì)粒能夠有效抑制糖尿病小鼠模型腎臟組織Gremlin的表達，抑制Gremlin表達后無論是腎臟早期增生、肥大、細胞增殖還是晚期腎臟細胞凋亡、腎臟纖維化及腎功能惡化都得到改善，抑制Gremlin表達后出現(xiàn)這些作用可能是通過使BMP7的表達及活性恢復(fù)