恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞永生細胞系構(gòu)建.pdf

1、背景和目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells．BMSCs)具有多向分化潛能和低免疫原性，是細胞移植治療和組織工程的良好選擇。然而我們研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcells from bone marrow of Rhesus monkey,RhBMSCs)體外增殖能力有限，傳至20代細胞生長基本停滯。這必然限制了其在細胞移植和組織工程等領(lǐng)域中的研

2、究和應(yīng)用。建立永生化細胞系可能會有效地解決這一問題，從而為生物醫(yī)學(xué)研究提供了標(biāo)準(zhǔn)化的工具細胞。 材料與方法： 采用不同的分離方法和不同的培養(yǎng)方案對3歲齡的恒河猴BMSCs進行分離培養(yǎng)，并從形態(tài)學(xué)、表面抗原、分化潛能以及核型等方面進行鑒定；將含有人源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reversetranscfiptase gene，hTERT)的質(zhì)粒載體pCI-neo-hTERT、穩(wěn)定轉(zhuǎn)入第2代RhB

3、MSCs，并對轉(zhuǎn)染細胞進行外源基因hTERT表達的RT-PCR檢測；通過特異性抗原(SH-2、SH-3、SB-10、CD29、CD34、CD45和HLA-DR)檢測、成骨誘導(dǎo)以及核型分析對細胞進行鑒定；傳代培養(yǎng)、MTS法和細胞凋亡的流式檢測分析細胞生長活性；裸鼠致瘤實驗測定其有無致瘤性。結(jié)果結(jié)果表明hTERT基因可以成功轉(zhuǎn)入RhBMSCs；轉(zhuǎn)基因RhBMSCs表現(xiàn)出旺盛的增殖活性，相對于第15代未轉(zhuǎn)基因RhBMSCs的33.5％的凋亡率

4、來說，第40代轉(zhuǎn)基因RhBMSCs的凋亡率只有4.5％，RhBMSCs的“壽命”明顯得到延長；轉(zhuǎn)基因RhBMSCs保持了正常RhBMSCs的細胞形態(tài)、克隆生長特性及核型；特異性抗原SH-2、SH-3、SB-10、CD29表達率均高于95％，CD34、CD45、HLA-DR表達率均低于4.5％，表型正常，純度較高；轉(zhuǎn)基因RhBMSCs保持了正常RhBMSCs的分化潛能；裸鼠致瘤實驗結(jié)果呈良性。 結(jié)論： 本研究證實了外源基因

5、hTERT已成功轉(zhuǎn)入RhBMSCs，首次通過轉(zhuǎn)入hTERT的方式使RhBMSCs的體外傳代“壽命”得以延長，細胞除了表現(xiàn)出旺盛的增殖活力外，其維持了與未轉(zhuǎn)染的細胞相類似的表型(SH-2、SH-3、SB-10、CD29、CD34、CD45和HLA-DR)、核型和分化潛能。這將為應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供穩(wěn)定、安全、充足的標(biāo)準(zhǔn)化工具細胞來源。另外，在構(gòu)建過程中涉及到的RhBMSCs分離、擴增、轉(zhuǎn)染、鑒定和分化的方法和結(jié)果，不僅有助于我們了解與之近似的