鱖SID-1和NCBP2基因的功能研究.pdf

1、為了研究病毒與宿主的相互作用,在傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleenand Kidney Necrosis Virus,ISKNV)感染鱖(Siniperca chuatsi)的抑制性消減cDNA文庫(kù)基礎(chǔ)上,經(jīng)比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性RNAi缺陷相關(guān)基因1(Systemic RNAInterference Defective1,SID-1)和核帽結(jié)合蛋白2(Nuclear Cap-Binding Protein2,NCB

2、P2)兩個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression Sequence Tag,EST)在病毒抗性鱖魚中表達(dá)上調(diào)。為探討兩者在宿主抵抗病毒感染中的作用,采用RACE技術(shù)調(diào)取了兩條基因全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 鱖SID-1 cDNA序列長(zhǎng)3380 bp,編碼855個(gè)氨基酸。氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物SID-1相似性在70％以上,而與家蠶(Bombyx mori)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)等相似性較低,在40％以下。

3、預(yù)測(cè)分析顯示,SID-1蛋白N末端310個(gè)氨基酸呈無規(guī)則卷曲位于細(xì)胞膜外側(cè),隨后為9個(gè)復(fù)雜的跨膜結(jié)構(gòu)域,C末端位于細(xì)胞內(nèi),其結(jié)構(gòu)在親緣關(guān)系近的生物中高度保守。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,SID-1在鱖魚體內(nèi)廣泛表達(dá),其中以肌肉、血細(xì)胞中最高,其它免疫器官頭腎、后腎、肝臟、脾臟及性腺中表達(dá)量也較高,而在心、腦、腸、皮及鰓中表達(dá)量較低。表達(dá)譜分析表明,ISKNV感染后,SID-1表達(dá)在血細(xì)胞、脾臟、鰓組織中呈現(xiàn)大致相同的規(guī)律,在感染后第3天

4、上升到最高,隨后表達(dá)水平逐步下降,第7天恢復(fù)到原有水平。而在頭腎中則呈相反的表達(dá)規(guī)律,在感染后第7天到達(dá)高值,并在表現(xiàn)ISKNV抗性的魚中表達(dá)量最高,這可能與魚類頭腎在免疫反應(yīng)過程中的重要地位有關(guān)。在體外細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)則呈現(xiàn)獨(dú)特的規(guī)律,首先是在病毒感染后第1天小幅下降,隨后隨著感染天數(shù)的增加,其轉(zhuǎn)錄水平一直穩(wěn)定增加,可能與體外條件下,缺乏生物體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。
　　 亞細(xì)胞定位分析表明,SID-1主要在細(xì)胞膜,在細(xì)胞內(nèi)部分

5、區(qū)域呈點(diǎn)狀聚集高表達(dá)。利用果蠅表達(dá)系統(tǒng)的分析表明,SID-1基因轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞后,可以高效的將dsRNA由培養(yǎng)液轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi),而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組不具此能力。對(duì)FHM細(xì)胞的分析表明,FHM細(xì)胞本身即具備由培養(yǎng)液中攝取dsRNA的能力,但穩(wěn)定表達(dá)SID-1基因后,其轉(zhuǎn)運(yùn)能力可提高5-9倍。利用G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)鱖SID-1基因的FHM細(xì)胞系,TFV感染實(shí)驗(yàn)顯示,在培養(yǎng)液中添加TFV病毒ORF097基因的dsRNA條件下,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SID

6、-1基因可將細(xì)胞病變時(shí)間推后3天；在不添加dsRNA條件下,也可將細(xì)胞病變時(shí)間推后2天。進(jìn)一步熒光實(shí)時(shí)定量PCR、western blot及病毒滴度測(cè)定均顯示,SID-1基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系病毒量均低于對(duì)照組,特別是在添加TFV病毒dsRNA的情況下,SID-1基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系病毒量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組,在病毒感染后第2、3天對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組病毒量高100倍以上(1.36E+00/1.11E-02、2.19 E+00/1.45E-02)。利用S

7、ID-1基因原核表達(dá)抗原片段,制備了抗SID-1蛋白高效價(jià)的多克隆腹水(anti-SID),在鱖魚Fry細(xì)胞進(jìn)行的抗體阻斷實(shí)驗(yàn)表明,在體外用抗體封閉SID-1蛋白的情況下,可提高ISKNV在細(xì)胞內(nèi)的病毒量,則從另一方面驗(yàn)證了SID-1在宿主細(xì)胞抵抗病毒感染過程中的重要作用。
　　 NCBP2基因全長(zhǎng)1088 bp,編碼164個(gè)氨基酸,具有一個(gè)RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域(RRM),符合核帽結(jié)合蛋白特征。氨基酸比對(duì)分析表明,NCBP2蛋白在進(jìn)

8、化中較為保守,與所比對(duì)生物相似性均在70％以上。其基因組結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)5093bp,包括5個(gè)外顯子,4個(gè)內(nèi)含子。亞細(xì)胞定位表明,NCBP2轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)彌散性表達(dá),但在細(xì)胞中央呈明顯的集聚狀表達(dá)。NCBP2基因轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞后,通過G418篩選及單克隆化,建立了NCBP2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。TFV感染穩(wěn)定表達(dá)NCBP2的FHM細(xì)胞后,通過觀察細(xì)胞病變、TFV病毒熒光實(shí)時(shí)定量PCR以及western blot分析,均表明穩(wěn)定表達(dá)NCBP2基因的細(xì)胞