蘋果MdSAMDC2和MdICE1基因的功能鑒定以及抗逆性研究.pdf

1、非生物脅迫嚴重影響植物的生長和發(fā)育，利用基因工程對作物進行遺傳改良提高其抗逆性，是保障作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)的有效途徑，具有廣闊的應用前景。多胺在植物細胞內(nèi)參與諸多生命活動，并參與植物的抗逆性形成，SAMDC是多胺生物合成的關(guān)鍵酶，蘋果MdSAMDC2基因的表達能夠被低溫、干旱和鹽等逆境誘導上調(diào)，而其在植物體內(nèi)的生物學功能還沒有驗證。為了確定MdSAMDC2的表達模式，本研究通過TAIL-PCR技術(shù)分離了該基因的啟動子，初步研究了該啟動子

2、的啟動活性；通過Gateway技術(shù)構(gòu)建了MdSAMDC2的植物表達載體，并導入煙草使該基因過量表達，進一步研究了逆境條件下該基因的表達水平，測定了各項抗性生理指標，表明過量表達MdSAMDC2能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性。ICEl(Inducer of CBF expression 1) 是CBF3的正調(diào)節(jié)因子，已有研究表明，過量表達ICE1能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性，說明ICEl在植物耐寒性形成中起重要作用。本研究從蘋果中克隆到M

3、dICE1基因，并對其表達和功能進行了初步研究，轉(zhuǎn)基因研究表明 MdICE1過量表達可以提高煙草的耐寒能力。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1、根據(jù) MdSAMDC2 基因的cDNA序列，設(shè)計了該基因編碼區(qū)的3′和5′端引物并進行克隆，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物表達載體，通過農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)入煙草，PCR檢測證明 MdSAMDC2 基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，RT-PCR表明MdSAMDC2在煙草中得到表達，所有轉(zhuǎn)基因植株生長正常，能

4、夠完成生活史。用HPLC測定了轉(zhuǎn)基因植株的多胺水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的多胺含量明顯上升，并且不同多胺的比例發(fā)生了變化，Spd 比例相對提高，Put和Spm的比例相對下降。分別用低溫、20％PEG模擬干旱和NaCl等逆境脅迫進行處理，分析了轉(zhuǎn)基因植株的抗逆生理生化變化，發(fā)現(xiàn)在逆境條件下，過量表達MdSAMDC2可以提高Spd和Spm的積累，降低Put含量，同時提高了脯氨酸含量以及SOD和CAT的酶活性，降低了MDA含量，表明轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性

5、得到了提高。 2、根據(jù)MdSAMDC2的5′端序列設(shè)計3條反向引物和4條隨機兼并引物，以蘋果基因組DNA為模板，利用改進TAIL-PCR 法克隆到了長度為680bp的 MdSAMDC2啟動子，序列分析表明，該啟動子區(qū)包含多種逆境誘導啟動子的特異序列元件，如ACGTA序列元件、ASF1元件、MYC識別位點、MYB1和MYB2識別位點等。構(gòu)建了該啟動子和GUS基因的重組表達載體，將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌LBA4404，用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入

6、煙草，GUS染色顯示轉(zhuǎn)基因煙草的葉片為藍色，表明該啟動子具有啟動活性。 3、為了驗證不同抗性水平蘋果砧木在逆境下的多胺反應，以山定子(M．baccataBorkh)、新疆野蘋果(M．sieversii (Ledeb) Roem)、煙臺沙果(M．pruntifolia (Willd)Borkh)和萊蕪難咽(M．micromalus Makino)等4種蘋果砧木為試材，測定了低溫脅迫下不同砧木葉片的多胺含量變化及MDA、抗氧化酶的變化等生理

7、指標。結(jié)果表明，低溫脅迫能明顯誘導多胺總量(PAs)、腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)的發(fā)生，耐寒性強的山定子和新疆野蘋果PAs、Put和Spd增加顯著，相關(guān)分析表明，葉片MDA相對增加量與PAs、Put和Spd的增加量呈極顯著負相關(guān)，與Put/PAs比值呈顯著負相關(guān)，而與(Spd+Spin)/rPut、Spd/PAs、Spm/PAs呈顯著正相關(guān)，表明當?shù)蜏孛{迫下葉片PAs、Put、Spd增加量較大時，蘋果砧木耐低溫脅迫

8、的能力比較強。 4、以蘋果為材料，利用同源序列法和RACE技術(shù)克隆蘋果MdICE1的全長cDNA序列(GenBank登錄號為EF495202)，該cDNA長度為1890bp，編碼531個氨基酸，保守性分析表明，MdICE1蛋白質(zhì)序列上包含由60個氨基酸殘基組成的bHLH(basicHelix-Loop-Helix)功能域，同源性比較表明，不同bHLH蛋白功能域的同源性高達90％以上。將該蛋白氨基酸序列與擬南芥等植物的bHLH蛋白

9、進行在線多重序列比較，并構(gòu)建系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)MdICE1與擬南芥ICE1(AAP14668)同源性最高，系統(tǒng)樹將這兩個蛋白聚為一類，因此可以確定MdICE1是擬南芥ICE1在蘋果中的一個同源基因，編碼bHLH類蛋白。表達和功能分析結(jié)果如下： ①構(gòu)建了MdICE1的原核表達載體pET-30(a)+MdICE1，轉(zhuǎn)化BL21，篩選重組菌株。經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大小為64.5kDa的特異蛋白產(chǎn)物。 ②將MdICE

10、1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞內(nèi)瞬時表達，只在細胞核中觀察到綠色熒光，表明MdICE1定位于細胞核，Northern雜交結(jié)果表明MdICE1表達受低溫和鹽脅迫誘導。 ③將MdICE1插入pBI121構(gòu)建表達載體，利用農(nóng)桿菌浸染法將35S∶∶MdICE1轉(zhuǎn)入煙草。PCR檢測表明 MdICE1已經(jīng)整合到煙草基因組中，RT-PCR 表明 MdICE1在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠表達。用低溫脅迫處理轉(zhuǎn)基因株系，分析了該基因表達模式和轉(zhuǎn)基因植株的