Disulfiram聯(lián)合Cu通過上調(diào)TNF-a表達(dá)及蓄積ROS誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一種在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)上具有異質(zhì)性的疾病，主要特點(diǎn)是原始及幼稚髓系白血病細(xì)胞在骨髓及外周血不斷的蓄積，是成人急性白血病(acute leukemia，AL)中最常見的一種類型。
　　雙硫侖(Disulfiram，DS)是二硫代氨基甲酸酯(DDTC)家族的成員之一，在臨床上作為常用的抗酗酒藥物已經(jīng)有60多年的歷史了，具有整合金屬離子的能力，例如銅、鋅

2、等金屬離子，并且能夠與巰基基團(tuán)和谷胱甘肽反應(yīng)。
　　活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是在細(xì)胞氧化代謝過程中不可避免產(chǎn)生的自然產(chǎn)物，它主要包括有非自由基（如H2O2）和自由基（羥基和超氧化合物），由于ROS具有高度的活性屬性，這樣可能會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的過氧化破壞，而在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞可以利用細(xì)胞內(nèi)的抗氧化及防御系統(tǒng)抵御這些有毒產(chǎn)物對自身的傷害，從而保持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定。然而，

3、當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化巨大時(shí)，打破了這種氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定，短時(shí)間急劇升高的ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　腫瘤壞死因子(tumor necrosises factor-alpha，TNF-a)是一個(gè)具有強(qiáng)勁促炎作用的細(xì)胞因子，對多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)具有多效性，對細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等一系列的細(xì)胞生命活動(dòng)過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　目的:
　　本課題建立CD34+CD38-KGlα細(xì)胞的AML干細(xì)胞模型，明確Disu

4、lfiram(DS)單藥及DS聯(lián)合Cu離子(DS/Cu)在體外誘導(dǎo)AML干細(xì)胞凋亡，并從ROS蓄積的角度出發(fā)，進(jìn)一步探討引起ROS上調(diào)的上游分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、應(yīng)用磁珠分選術(shù)分選出人急性髓系白血病細(xì)胞株KG1α細(xì)胞;
　　2、Annexin-V標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測DS(5μM)及DS/Cu(5μM/0.5μM)對CD34+CD38-KG1α細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，并比較與對照組Control之間的關(guān)系;

5、　　3、利用DCFA-DA法，流式細(xì)胞術(shù)檢測DS及DS/Cu作用24h后CD34+CD38-KG1α細(xì)胞中ROS水平的變化，比較各組之間ROS變化率(ROS變化率=測試組/空白對照組)的差別;
　　4、利用Annexin-V標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測DS/Cu聯(lián)合ROS清除劑NAC(10mM)后的對CD34+CD38-KG1α細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力，并比較其與DS/Cu誘導(dǎo)凋亡能力的差異;
　　5、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測空白對照

6、、DS(5μλM)、DS/Cu5μM/0.5μM)及DS/Cu+NAC5μM/0.5Mm/10Mm)處理CD34+CD38-KG1α細(xì)胞24h后TNF-a、CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK等凋亡基因表達(dá)的變化，采用2-△ct法對PCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，分析各種不同處理組上述基因的mRNA表達(dá)變化。
　　6、利用Western Blot法檢測空白對照、DS、DS/Cu及DS/Cu+NAC處理CD34+CD38-KG

7、1αt細(xì)胞24h后TNF-a蛋白水平，并比較各組之間TNF-a蛋白表達(dá)量的變化。
　　7、利用DCFA-DA法，流式細(xì)胞術(shù)檢測Control、DS/Cu、TNF-amAb(2μg/mL)、TNF-a mAb(2μg/mL)+DS/Cu、IgG(2μg/mL)及IgG(2μg/mL)+DS/Cu作用24h后CD34+CD38-KGlα細(xì)胞巾ROS水平的變化，比較各組之間ROS變化率的差別;
　　8、利用Annexin-V標(biāo)記，

8、流式細(xì)胞術(shù)檢測Control、DS/Cu、TNF-amAb(2μμg/mL)、TNF-a mAb(2μg/mL)聯(lián)合DS/Cu、IgG(2μg/mL)及IgG(2μg/mL)聯(lián)合DS/Cu作用24h后對CD34+CD38-KG1α細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力，并比較Control、TNF-a mAb、IgG組之間的凋亡差別及Control、DS/Cu、TNF-amAb+DS/Cu、IgG+DS/Cu組之間的凋亡差別;
　　9、采用SPSS1

9、3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用M+S表示，兩組間均數(shù)的比較使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法;多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在方差分析顯著的情況下采用LSD方法（方差齊性分析）進(jìn)行多重比較，方差不齊情況下采用近似F檢驗(yàn)代替方差分析后采用Dunnett's T3方法進(jìn)行多重比較（檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)，NS代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*代表P＜0.05，**代表P≤0.01，***代表P≤0.001）。
　　結(jié)果:

10、>　　1、AML干細(xì)胞模型建立。采用抗人CD34-APC、CD38-PE雙抗標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測具有干細(xì)胞特性的CD34+CD38-亞群細(xì)胞比例，分選前CD34+CD38-亞群細(xì)胞占KG1α細(xì)胞比例為(64.73±2.01)％，經(jīng)MACS分選后CD34+CD38-KG1α細(xì)胞比例為(95.37±1.84)％。
　　2、DS及DS/Cu均能誘導(dǎo)AML干細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示空白對照組、DS單藥組及DS/Cu組凋亡細(xì)胞比例分別為(6.6

11、5±0.64)％、(11.87±1.30)％和(27.43±1.65)％，DS單藥組和DS/Cu組誘導(dǎo)AML干細(xì)胞凋亡的比例明顯高于空白對照組（P=0.008和P=0.001），此外，DS/Cu組誘導(dǎo)AML干細(xì)胞凋亡的比例也顯著高于DS單藥組(P＜0.001)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，我們可以認(rèn)為DS、DS/Cu均可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但聯(lián)合Cu后可以明顯增強(qiáng)DS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力。
　　3、DS及DS/Cu均能使AML干細(xì)胞內(nèi)ROS蓄

12、積。結(jié)果顯示空白對照組、DS單藥組及DS/Cu組ROS水平分別為(359.67±32.50)、(497.38±36.85)、(1008.93±83.72)，DS單藥組及DS/Cu組ROS水平較空白對照組上升了(1.39±0.12)倍、(2.81±0.11)倍（P=0.028和P=0.001）;并且DS單藥組與DS/Cu組 ROS變化率也有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。以上統(tǒng)計(jì)分析表明，DS、DS/Cu組均能誘導(dǎo)AML干細(xì)胞ROS蓄

13、積，但DS/Cu誘導(dǎo)能力顯著高于DS單藥組。
　　4、NAC清除ROS蓄積可以抑制DS/Cu誘導(dǎo)的AML干細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示DS/Cu組及DS/Cu+NAC組ROS水平分別為(1008.93±83.72)、(413.95±70.90)，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有明顯差異(P=0.001)，細(xì)胞凋亡比例分別為(27.43±1.65)％、(12.37±0.85)％，統(tǒng)計(jì)學(xué)同樣具有明顯差異(P=0.001)。以上結(jié)果分析表明，加入ROS清除劑NAC后可

14、以挽救DS/Cu引起的細(xì)胞凋亡，說明ROS是造成細(xì)胞凋亡的重要因素。
　　5、TNF-α是DS/Cu誘導(dǎo)AML干細(xì)胞ROS蓄積的上游基因。設(shè)置空白對照、DS單藥(5μ mol/L)、DS/Cu(5μ mol/L/0.5μ mol/L)及DS/Cu+NAC(5μmol/L/0.5μ mol/L/10m mol/L)4組，上述各組藥物處理CD34+CD38-KG1α24h后，qRT-PCR驗(yàn)證與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的基因TNF-(α、CD40

15、、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK的mRNA水平，結(jié)果表明，TNF-a是DS/Cu誘導(dǎo)AML干細(xì)胞ROS蓄積的上游分子，而CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK的表達(dá)受ROS的水平調(diào)控。
　　6、中和TNF-α可以抑制DS/Cu誘導(dǎo)的AML干細(xì)胞ROS的蓄積。先予以中和抗體TNF-α mAb(2μg/ml)及對照抗體IgG(2μg/ml)預(yù)處理CD34+CD38-KG1o細(xì)胞2h，設(shè)置空白對照組、DS/

16、Cu組、TNF-α mAb組、TNF-α mAb+DS/Cu組、IgG組、IgG+DS/Cu組（DS、Cu溶度同前），不同處理作用CD34+CD38-KG1α細(xì)胞24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS水平。
　　7、中和TNF-α可以挽救DS/Cu誘導(dǎo)的AML干細(xì)胞凋亡。先予以中和抗體TNF-α mAb及對照抗體IgG預(yù)處理CD34+CD38-KG1α細(xì)胞2h，設(shè)置空白對照組、DS/Cu組、TNF-α mAb組、TNF-α mAb+

17、DS/Cu組、IgG組、IgG+DS/Cu組（溶度同前），不同處理作用CD34+CD38-KG1α細(xì)胞24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)論:
　　1、DS和DS/Cu均可誘導(dǎo)AML干細(xì)胞凋亡，而且DS/Cu誘導(dǎo)AML干細(xì)胞凋亡的能力較DS單藥顯著。
　　2、DS/Cu可顯著提高AML干細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，加入ROS清除劑NAC后可以顯著挽救DS/Cu誘導(dǎo)的AML干細(xì)胞的凋亡，說明細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積是DS/