LPS通過上調(diào)let-7e的表達(dá)抑制MDSC的凋亡.pdf

1、早在30年前髓樣來源的抑制性細(xì)胞（MDSC，myeloid-derived suppressor cells）在腫瘤病人中就已被報(bào)道，最近幾年其在免疫系統(tǒng)中的作用得到廣泛研究。事實(shí)上，很多證據(jù)已經(jīng)證明 MDSC對腫瘤和其他疾病中的免疫應(yīng)答起著很重要的負(fù)性調(diào)控作用。MDSC不僅對 T細(xì)胞免疫應(yīng)答有抑制作用，它們亦可以通過細(xì)胞因子等對先天免疫應(yīng)答發(fā)揮抑制作用。
　　它是一個未充分分化成成熟細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞群，缺乏成熟細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨

2、噬細(xì)胞、DC的表面標(biāo)記，但具有單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的形態(tài)。在小鼠體內(nèi)MDSC為Gr1+CD11b+，它大約占正常小鼠的骨髓細(xì)胞的20-30％、脾臟細(xì)胞的2-4%。MDSC的顯著特點(diǎn)是在病理?xiàng)l件下顯著擴(kuò)增,而 MDSC的擴(kuò)增是MDSC發(fā)揮作用的一個重要顯著特征。是何種因素導(dǎo)致 MDSC的擴(kuò)增一直不太清楚。盡管有報(bào)道認(rèn)為很多來源于腫瘤細(xì)胞和 T細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子參與了MDSC的擴(kuò)增，如VEGF、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IFNγ、

3、SCF、TGFβ、IL-1β、IL-10、IL-12、IL-13等等，但其作用機(jī)制尚很不明了。探討MDSC擴(kuò)增的機(jī)制是進(jìn)一步了解MDSC作用及如何調(diào)控其免疫抑制作用的重要前提。
　　已有的研究表明 LPS處理的MDSCs數(shù)量增加，且向 M1型極化，但 LPS是如何使MDSCs數(shù)量增多，又如何使MDSCs向M1型細(xì)胞極化，目前機(jī)制方面研究還很缺乏。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼，能參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的

4、小分子RNA，長度一般約為22個核苷酸。從上世紀(jì)90年代在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個microRNA--Lin4之后，經(jīng)過多年研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs的功能涉及到很多的生物學(xué)及生理學(xué)、病理學(xué)過程，如細(xì)胞的增殖分化和凋亡、個體發(fā)育和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有的研究表明miRNAs在免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞的分化發(fā)育也起著十分重要的作用。由此，我們提出LPS是否通過調(diào)控miRNAs的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MDSCs的擴(kuò)增或者數(shù)量的增多？
　　為此，我們首先

5、應(yīng)用LPS處理MDSCs，通過microarray檢測LPS處理后的MDSCs的MiRNAs的變化，發(fā)現(xiàn)LPS處理后的MDSCs的microRNA的表達(dá)譜和未處理組相比呈現(xiàn)顯著的變化，說明LPS處理MDSCs的擴(kuò)增或數(shù)量的增多可能通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。我們仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)miRNA let-7e在處理組和非處理組有非常顯著差異。由此在本課題中，我們擬爭對以下幾個科學(xué)問題進(jìn)行研究：1.LPS通過何種途徑調(diào)控let-7e表達(dá)；2.建立

6、let-7e過表達(dá)嵌合小鼠動物模型，分析是否過表達(dá)let-7e可以引起MDSCs的擴(kuò)增；3.應(yīng)用分子生物學(xué)方法分析let-7e的靶基因，研究let-7e使MDSCs擴(kuò)增或數(shù)量增多的作用機(jī)制。
　　我們首先應(yīng)用100ng LPS注射到B6小鼠腹腔中，30小時(shí)后，取骨髓和脾臟的細(xì)胞，制備單個細(xì)胞懸液后，用CD11b、Gr熒光抗體染色后，用FACS分析發(fā)現(xiàn)：LPS處理的小鼠的骨髓和脾臟中的Gr+CD11b+小鼠的MDSCs比例比未注射組

7、顯著升高。Microarray結(jié)果顯示LPS處理的MDSCs中的let-7e、mir-21、mir-325等表達(dá)明顯上升，而mir-122，mir-695、mir-30等表達(dá)明顯下降。為進(jìn)一步分析LPS通過何種途徑調(diào)控了let-7e表達(dá)，我們應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子分析軟件對let-7e基因啟動序列前2000bp分析何種轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合在let-7e啟動子部位，發(fā)現(xiàn)GATA1/GATA2可能調(diào)控了let-7e表達(dá)。我們通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了GAT

8、A1/GATA2對let-7e調(diào)控的可能性，并進(jìn)一步通過不同大小的啟動子片段限定了GATA1/GATA2與let-7e結(jié)合的最小區(qū)域。
　　為研究 let-7e是否調(diào)控 MDSCs的擴(kuò)增或數(shù)量，首先我們構(gòu)建pMDH1-PGK-GFP-let-7e過表達(dá)質(zhì)粒，并通過let-7e特定PCR以及應(yīng)用FACS檢測GFP表達(dá)來驗(yàn)證我們所構(gòu)建的pMDH1-PGK-GFP-let-7e能成功表達(dá)let-7e。在此基礎(chǔ)上，為更好的研究let-7e

9、對MDSCs的影響，我們通過制備let-7e的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染骨髓干細(xì)胞，并建立let-7e過表達(dá)嵌合小鼠模型，通過FACS和PCR檢測證明我們的嵌合小鼠模型成功建立。進(jìn)一步通過FACS分析發(fā)現(xiàn)：在嵌合小鼠中，其T細(xì)胞亞群的比例在GFP+和GFP-細(xì)胞群中無顯著差異。而無論是骨髓還是脾臟GFP+細(xì)胞中MDSC都顯著高于其在GFP-細(xì)胞群中的比例。提示let-7e過表達(dá)后確實(shí)引起MDSCs數(shù)量的增多。
　　為了研究let-7e是如何

10、促進(jìn)MDSC的增多，我們通過注射Brdu到let-7e過表達(dá)嵌合小鼠體內(nèi)，12小時(shí)后檢測發(fā)現(xiàn)let-7e過表達(dá)小鼠的MDSCs Brdu陽性百分比與WT小鼠相比，無顯著差異，提示let-7e并不影響MDSC細(xì)胞的增殖或自我更新。但應(yīng)用AnnexinV染色發(fā)現(xiàn)，let-7e過表達(dá)小鼠的MDSCs凋亡和WT小鼠相比顯著減少，這一結(jié)果提示 MDSCs數(shù)量增多可能是由于 Let-7e阻止MDSC細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的。然后，我們通過軟件分析和 PCR、

11、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)western-blot等預(yù)測和驗(yàn)證 let-7e在MDSC擴(kuò)增中的作用機(jī)制。結(jié)果提示 let-7e可能通過調(diào)控Caspase-3、Caspase-7的表達(dá)來抑制MDSCs的凋亡。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn) LPS能使 MDSCs的數(shù)量增多，其可能的機(jī)制之一是通過調(diào)控GATA1、GATA2來促進(jìn)let-7e表達(dá)，而let-7e進(jìn)一步通過阻止caspase-3、Caspase-7的表達(dá)從而進(jìn)一步抑制MDSCs的凋