內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化及其機(jī)制研究.pdf

1、現(xiàn)代社會文明進(jìn)步發(fā)展的同時(shí),也帶來了人類社會第一大公害“創(chuàng)傷”的大量發(fā)生,創(chuàng)傷被稱為“發(fā)達(dá)社會病”。脊柱、脊髓損傷(spinal cord iniury,SCI)是交通、勞動(dòng)和運(yùn)動(dòng)等意外事故中常見的創(chuàng)傷類型。脊髓損傷是人類致殘率最高的疾患之一,一直是困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。它可直接導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的感覺、運(yùn)動(dòng)功能喪失及排尿、排便功能障礙。損傷的平面越高,患者喪失的功能越多。美國有截癱患者約253000例,每年新增約11000例,每年為這些

2、截癱患者支付的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)60億美元,而在中國截癱患者人數(shù)約40萬,每年新增1萬人,給患者、家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。但到目前為止國內(nèi)外治療脊髓損傷的藥物和外科手術(shù)雖均有進(jìn)展,但卻未取得滿意的臨床療效。因此,加強(qiáng)SCI救治與截癱康復(fù)的研究具有重要的社會現(xiàn)實(shí)需求和科學(xué)理論價(jià)值。
　　 近年興起的利用組織工程學(xué)的方法來修復(fù)脊髓損傷給脊髓損傷患者帶來了新的希望。組織工程學(xué)是生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)中的一個(gè)新的分支,是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和

3、技術(shù),構(gòu)建人工組織以修復(fù)組織器官的結(jié)構(gòu)和功能。其主要的研究內(nèi)容包括:種子細(xì)胞的篩選、支架材料的合成與塑型以及組織的構(gòu)建。目前,用于構(gòu)建脊髓組織工程的種子細(xì)胞主要包括:胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。種子細(xì)胞主要通過以下方式來修復(fù)脊髓損傷:1)替代損傷或死亡的細(xì)胞;2)橋接脊髓損傷斷端,形成功能性突觸,重新建立神經(jīng)傳導(dǎo)通路;3)改善臨床癥狀,提供神

4、經(jīng)保護(hù)和生長因子使受損的軸突易于再生;4)起到其他的間接作用:如促進(jìn)血管生成,為再生和內(nèi)生細(xì)胞提供營養(yǎng)支持。
　　 NSCs被認(rèn)為是構(gòu)建脊髓組織工程最佳的種子細(xì)胞。NSCs為多能干細(xì)胞,終身具有自我更新能力和多向分化潛能,無論是在哺乳動(dòng)物胚胎神經(jīng)組織還是成年個(gè)體的腦組織中都存在,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)新生細(xì)胞產(chǎn)生的源泉。NSCs在一定條件下能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。并且,NSCs具有易于獲取、培養(yǎng)方法成熟,鑒定容易,

5、可在體外大量增殖、分化等優(yōu)點(diǎn),適合作為組織工程神經(jīng)移植物實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞。盡管從理論上講NSCs的功能完美無缺,但近年來研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)NSCs應(yīng)用于成年SCI的治療存在如下問題:移植后NSCs分化為神經(jīng)元少,無法提供大量功能性軸突連接所需的神經(jīng)元,而膠質(zhì)細(xì)胞大量增生,形成的膠質(zhì)瘢痕不利于軸突再生;由于損傷脊髓局部的血運(yùn)不能得到及時(shí)恢復(fù),變性壞死組織及毒性產(chǎn)物不能很快清除,使移植物中的神經(jīng)細(xì)胞得不到充分的血管營養(yǎng)支持,導(dǎo)致細(xì)胞存活時(shí)間短,神經(jīng)

6、干細(xì)胞增殖分化困難,達(dá)不到應(yīng)有的治療效果。因此,如何促進(jìn)移植到損傷脊髓的NSCs向神經(jīng)元分化、促進(jìn)損傷脊髓血管再生以保證移植細(xì)胞的血管營養(yǎng)支持,成為利用NSCs及其構(gòu)建的組織工程移植物移植修復(fù)損傷脊髓亟待解決的關(guān)鍵問題之一。
　　 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)是Asahara等在1997年首次從成體外周血中分離,并證實(shí)在人類出生后的外周循環(huán)血液中存在,能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的

7、前體細(xì)胞。EPCs是一群具有游走特性,并能增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,包括從血液血管母細(xì)胞到成熟內(nèi)皮細(xì)胞之間多個(gè)階段的細(xì)胞,亦稱為血管母細(xì)胞或血管內(nèi)皮干細(xì)胞,不僅參與胚胎時(shí)期血管發(fā)生,而且在出生后成體血管新生過程中也起重要作用。EPCs能遷移并結(jié)合到血管再生的部位,增殖、分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,參與局部新生血管的形成。EPCs的這些特性使其具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值,可作為組織工程中血管的種子細(xì)胞來源。近年來,有關(guān)EPCs在組織工程血管再

8、生中作用的研究主要集中在缺血心肌、缺血肢體、損傷皮膚和損傷角膜等方面,還尚未用于脊髓損傷。我們擬選用NSCs和EPCs作為種子細(xì)胞,構(gòu)建血管化組織工程脊髓來修復(fù)損傷的脊髓,以同時(shí)解決脊髓損傷后的“神經(jīng)營養(yǎng)”和“血管營養(yǎng)”,這兩大問題。然而,NSCs和EPCs來源于體內(nèi)不同胚層,體內(nèi)和體外對周圍生長的環(huán)境要求不同。要同時(shí)移植這兩種細(xì)胞到宿主體內(nèi),需先在體外對這兩種種子細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)以探討兩者最佳的生長條件以及共培養(yǎng)后兩者生物學(xué)特性的變化規(guī)

9、律,從而為構(gòu)建血管化細(xì)胞組織工程移植修復(fù)脊髓損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供可行性實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)擬從大鼠的外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)后獲得EPCs,在體外與NSCs進(jìn)行共培養(yǎng),觀察兩者生長情況及NSCs的分化方向,然后對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 主要方法和技術(shù)路線
　　 實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分
　　 1.采用孕齡14d的SD胎鼠大腦皮層組織,分離純化培養(yǎng)NSCs,血清誘導(dǎo)NSCs分化。分別采用

10、Nestin、β-tubulin-Ⅲ和GFAP對NSCs球、分化后的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用密度梯度離心法從重約180g的SD大鼠外周血中得到單個(gè)核細(xì)胞,通過貼壁培養(yǎng)、體外擴(kuò)增獲取細(xì)胞,通過觀察細(xì)胞形態(tài)、CD34/Ⅶ因子免疫熒光反應(yīng)等方法進(jìn)行鑒定。
　　 2.在體外進(jìn)行EPC與NSCs共培養(yǎng),按培養(yǎng)基不同分為NB培養(yǎng)基組、DMEM培養(yǎng)基組和NB+DMEM培養(yǎng)基組,觀察兩種種子細(xì)胞生長情況,以尋找最佳條件培養(yǎng)基。觀察EP

11、Cs對NSCs增殖和分化的調(diào)控作用,并初步探討兩者不同比例情況下,NSCs分化變化規(guī)律。
　　 3.初步探討體外共培養(yǎng)的EPCs調(diào)控NSCs分化為神經(jīng)元的作用機(jī)制。ELISA法檢測EPCs、NSCs及兩者共培養(yǎng)的上清液VEGF、BDNF含量。觀察VEGF、bFGF聯(lián)合應(yīng)用對NSCs分化的影響,并利用VEGF的抗體進(jìn)一步探討VEGF是否在EPCs與NSCs共培養(yǎng)時(shí),促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化中起重要作用。
　　 4.統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)分析:各組數(shù)據(jù)以(x)±s表示,運(yùn)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為顯著水平,P＜0.01為非常顯著。
　　 主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.胎鼠大腦皮層NSCs豐富,易于獲取,培養(yǎng)的NSCs可在體外擴(kuò)增,并在一定的條件下能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。大鼠外周血來源豐富,取材方便,分離出的EPCs在特定的培養(yǎng)條件下能分化為內(nèi)皮細(xì)胞。提示本實(shí)驗(yàn)方法能夠體外成功培養(yǎng)出NSCs和EPC

13、s種子細(xì)胞。
　　 2.EPCs與NSCs共培養(yǎng)時(shí),最適合的條件培養(yǎng)基為NB+DMEM(1:1)。在此條件下,EPCs能明顯促進(jìn)NSCs的增殖,且調(diào)控NSCs定向分化為神經(jīng)元的比例(68.40％)明顯高于單純血清誘導(dǎo)組(28.7％)。且隨著EPCs:NSCs的比例由1:10到10:1,這種分化誘導(dǎo)作用越顯著。提示本實(shí)驗(yàn)所建立的EPCs與NSCs共培養(yǎng)體系是可行的,且在該體系中EPCs能明顯促使NSCs向神經(jīng)元方向分化。
　

14、　 3.ELISA法檢測EPCs及其與NSCs共培養(yǎng)時(shí)上清液中的VEGF分別為817.23pg/ml、917.78 pg/ml,明顯高于NSCs單培養(yǎng)時(shí)363.67 pg/ml,表明EPCs主要分泌VEGF。
　　 4.VEGF、bFGF誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元的比率分別為60.3％、60.4％,兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)神經(jīng)元分化比率明顯提高達(dá)80.3％。表明VEGF能明顯促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化,且與bFGF有協(xié)同作用。