基因工程培育抗病(稻瘟病、條紋葉枯病)轉(zhuǎn)基因水稻.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，但是病害，尤其是稻瘟病、條紋葉枯病，對(duì)世界各國稻區(qū)水稻的生產(chǎn)造成了極嚴(yán)重的影響。培育水稻抗病新品種，提高植物的廣譜抗性，這是當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要研究課題之一，也是關(guān)系到國計(jì)民生的重大問題。
　　Rs-AFP1基因作為從萌發(fā)的小蘿卜種子內(nèi)提取的一種多肽，屬于γ-硫堇蛋白，已證明其在離體條件下能夠抑制多種真菌生長(zhǎng)；白藜蘆醇是植物處于惡劣環(huán)境下或遭到病原體侵害時(shí)，植物自身分泌的一種可抵御病菌感染的抗菌素，

2、作為一種重要的植保素，它能夠增強(qiáng)植物抵抗病原體的能力，并被證明對(duì)多種真菌性病害有抑制作用，而白藜蘆醇合成酶作為其合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)植物體內(nèi)白藜蘆醇合成及代謝具有重要的調(diào)控作用。
　　本研究中，我們分別從萌發(fā)的小蘿卜種子及花生未成熟種子 cDNA文庫中分離出Rs-AFP1基因以及白藜蘆醇合成酶基因PNRSC。對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并將它們分別構(gòu)建入經(jīng)改造的以玉米泛素Ubiquitin為啟動(dòng)子、以bar基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因

3、的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)黃淮區(qū)主栽品種“圣稻13”的成熟胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并獲得13株轉(zhuǎn)Rs-AFP1基因的植株以及7株轉(zhuǎn)PNRSC基因的植株。通過除草劑Basta涂抹以及PCR分子鑒定，確定轉(zhuǎn)化Rs-AFP1基因的第1、4、6、7、10、13株系為陽性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化PNRSC基因的第1、2、3、4、5、6株系為陽性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)一步對(duì)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株提取總蛋白液進(jìn)行稻瘟病菌體外的抗性鑒定、

4、田間自然發(fā)病情況下的抗病性檢測(cè)以及對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行室內(nèi)苗期稻瘟病菌接種性鑒定，初步研究結(jié)果表明，各陽性轉(zhuǎn)基因植株的總蛋白提取液在體外對(duì)稻瘟病菌具有一定程度上的抑制作用；在田間自然發(fā)病情況下，野生型圣稻感染了稻瘟病，而相同生長(zhǎng)條件下的各陽性轉(zhuǎn)基因株系均未感??；對(duì)T1代陽性轉(zhuǎn)基因株系的三葉一心期進(jìn)行室內(nèi)稻瘟病菌接種性鑒定，轉(zhuǎn)化 Rs-AFP1基因的各陽性株系中，除第10株系表現(xiàn)為感病外，其余均表現(xiàn)為抗病，轉(zhuǎn)化PNRSC基因的各陽性株系中，除

5、第2株系表現(xiàn)為感病外，其余均表現(xiàn)為抗病。由此可見，外源Rs-AFP1基因及白藜蘆醇合成酶基因PNRSC的導(dǎo)入均可在一定程度上提高目標(biāo)植物對(duì)病害的耐性及抗性，從而為水稻抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因新品種的培育提供了候選材料。
　　水稻條紋葉枯病病毒即RSV的基因組由4個(gè)獨(dú)立的單鏈RNA大分子組成，按照分子量大小分別命名為RNA1～RNA4。利用由pUC19改造的具有兩對(duì)同尾酶的RNAi載體分別與RSV的單鏈RNA正向和反向連接，中間含有一段內(nèi)含子

6、，從而使正鏈和反鏈互補(bǔ)形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，根據(jù)RNA干擾的原理，該表達(dá)載體導(dǎo)入植物體后如遇到RSV的侵染，將產(chǎn)生使RSV的單鏈RNA沉默的結(jié)果，從而使其無法表達(dá)而喪失致病性。研究中我們根據(jù)RSV的4個(gè)單鏈RNA分別設(shè)計(jì)了12對(duì)引物，利用感染病毒的水稻葉片所提取的RNA為模板，通過RT-PCR以及PCR技術(shù)克隆出5個(gè)水稻條紋葉枯病毒不同的cDNA片段，將它們分別命名為OsRSV(1-5)，然后構(gòu)建RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃淮區(qū)主

7、栽品種“圣稻13”，獲得了4株轉(zhuǎn)OsRSV1片段的轉(zhuǎn)基因植株、6株轉(zhuǎn)OsRSV2片段的轉(zhuǎn)基因植株、5株轉(zhuǎn)OsRSV3片段的轉(zhuǎn)基因植株、7株轉(zhuǎn)OsRSV4片段的轉(zhuǎn)基因植株、11株轉(zhuǎn)OsRSV5片段的轉(zhuǎn)基因植株，通過除草劑Basta涂抹以及PCR分子鑒定確定陽性轉(zhuǎn)基因株系，并對(duì)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行田間自然發(fā)病情況下的抗病性觀察。初步結(jié)果表明，野生型圣稻感染了條紋葉枯病，而相同生長(zhǎng)條件下的各陽性轉(zhuǎn)基因株系均未感病。接下來我們將對(duì)各陽性轉(zhuǎn)

8、化材料進(jìn)行抗蟲性、抗病性鑒定，進(jìn)而篩選出抗病有效區(qū)段，為進(jìn)一步培育抗條紋葉枯病的水稻新品系提供材料。
　　綜上所述，本研究利用基因工程手段解決稻瘟病、條紋葉枯病相關(guān)的水稻病害問題，并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因陽性的黃淮稻區(qū)水稻主栽品種進(jìn)一步進(jìn)行抗病能力的篩選及檢測(cè)，以期能培育并獲得抗稻瘟病、抗條紋葉枯病能力提高的轉(zhuǎn)基因水稻新品種。該方面的工作是保障我國未來食物安全、人民健康的需要，也是環(huán)境保護(hù)、能源替代的需要，更是轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需要。