NFAT調(diào)控皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細(xì)胞凋亡中FasL表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族成員，可傳導(dǎo)由特定的死亡配體引起的凋亡信號(hào)。激活這些受體的配體屬于腫瘤壞死因子超基因家族。FasL是Fas在體內(nèi)的天然配體，膜結(jié)合型和可溶性的FasL均可與Fas交聯(lián)，并誘導(dǎo)Fas三聚體的形成，繼而導(dǎo)致Fas分子膜質(zhì)區(qū)的死亡域與另一種具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白結(jié)合，促使FADD N端的死亡域與胱天蛋白酶8酶原相互作用并激活Caspase-8，最終導(dǎo)致表達(dá)Fas的細(xì)胞呈生理性死亡。 Fa

2、sL基因編碼的產(chǎn)物是一種介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要跨膜蛋白，其表達(dá)調(diào)控涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的參與。胞外刺激因素可通過(guò)調(diào)節(jié)多種與FasL相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性來(lái)影響FasL的表達(dá)水平，并最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的凋亡。在T細(xì)胞中，F(xiàn)asL的表達(dá)主要是受NFAT調(diào)控，其過(guò)程涉及到在Ca<’2+>或及鈣調(diào)蛋白的參與下，經(jīng)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活的一系列步驟。免疫抑制劑環(huán)胞菌素A可抑制CaN的活性，使NFMT的去磷酸化反應(yīng)及向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的過(guò)程受阻，最終影響其對(duì)FasL表

3、達(dá)的調(diào)控。 本研究分為四個(gè)部分： 第一部分：Ca<'2+>／CaN依賴的信號(hào)通路參與皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的MLTC凋亡中FasL的表達(dá) 先前的研究結(jié)果使得在以MLTC作為細(xì)胞模型的本研究中，為闡明在皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中有關(guān)NFAT調(diào)控FasL表達(dá)的機(jī)制，需先證實(shí)在皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的MLTC凋亡中同樣有Ca抖濃度升高、增加的CaN活性和FasL表達(dá)量及存在NFAT表達(dá)的事實(shí)。 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)Annexin V

4、-FITC／PI雙標(biāo)的Leydig細(xì)胞，結(jié)果顯示：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTC的凋亡率較未處理組有顯著增加。經(jīng)CsA和皮質(zhì)酮共同處理的細(xì)胞，其凋亡率則顯著減少。將經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTC基因組DNA提取后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，存在凋亡特有的DNA ladder條帶。利用鈣定性探針Fluo-3／AM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的MLTc，其Ca<'2+>濃度顯著增加。采用酶底物法測(cè)定細(xì)胞中CaN活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100nM

5、皮質(zhì)酮處理的MLTC，其CaN活性顯著升高，但這一升高的活性可被CaN的抑制劑CsA抑制。用RT-PER和Wes ternblot檢測(cè)經(jīng)100rN皮質(zhì)酮處理的MLTC中FasL的表達(dá)，結(jié)果表明：處理組FasL mRNA和蛋白表達(dá)水平與未處理組相比均呈顯著增加。經(jīng)皮質(zhì)酮和CsA共同處理的細(xì)胞，其FasL mRNA和蛋白表達(dá)水平則與對(duì)照組無(wú)顯著差異。用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在MLTC中有NFAT2的表達(dá)，證實(shí)該

6、細(xì)胞表達(dá)NFAT2。 本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在MLTC中可能同樣存在Ca<'2+>／CaN依賴的信號(hào)通路，因細(xì)胞經(jīng)高濃度皮質(zhì)酮處理后，ca<'2+>和CaN的變化與細(xì)胞中FasL的表達(dá)呈正相關(guān)。尤其是證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子NFAT2在MLTC中也有表達(dá)。 第二部分：FasL啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建及其活性分析 本部分的研究是通過(guò)構(gòu)建含有FasL啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體來(lái)觀察在皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中，調(diào)控FasL的表

7、達(dá)是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。并由此確定FasL啟動(dòng)子的核心序列，此可為進(jìn)一步研究調(diào)控區(qū)中順式作用元件的位置及與之相互作用的反式作用因子的種類和功能，并為最終闡明調(diào)控FasL表達(dá)的機(jī)制提供可能。 首先提取小鼠基因組DNA，利用PCR方法擴(kuò)增了長(zhǎng)度為689bp的FasL基因5’非編碼區(qū)片段，在此基礎(chǔ)上再分別擴(kuò)增長(zhǎng)度為329bp、272bp、238bp、209bp及138bp的5’非編碼區(qū)片段。將上述片段分別與pGL3-Basic載體連接，

8、構(gòu)建成含有FasL啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體。利用脂質(zhì)體將含有不同長(zhǎng)度的FasL啟動(dòng)子報(bào)告載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞，經(jīng)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同的報(bào)告載體均能顯示出不同程度的表達(dá)活性。 本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：含有FasL啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體已被成功構(gòu)建。在經(jīng)高濃度皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中，F(xiàn)asL啟動(dòng)子的核心調(diào)控元件位于-201-+71范圍內(nèi)。 第三部分：NFAT活性的初步研究

9、 在免疫系統(tǒng)中，NFAT對(duì)FasL表達(dá)的調(diào)控作用取決于前者能否被活化。活化的NFAT從胞漿移至核內(nèi)，與FasL啟動(dòng)子結(jié)合、相互作用。因此，評(píng)價(jià)NFAT在皮質(zhì)酮處理前后的Leydig細(xì)胞中的定位情況是分析其功能的前題。在本部分的工作中，我們用EGFP標(biāo)記法觀察皮質(zhì)酮處理前后的Ieyidg細(xì)胞中NFAT2的位置改變情況。此外，我們還構(gòu)建了表達(dá)NFAT2的細(xì)胞株，此可為進(jìn)一步研究NFAT調(diào)控FasL的表達(dá)機(jī)制提供幫助。 利用RT-P

10、CR方法從淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增NFAT2的編碼序列，經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)該序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致后，將其與真核表達(dá)載體pEGFP-C1連接，構(gòu)建pEGFP-NFAT2融合的表達(dá)載體。挑取陽(yáng)性克隆后進(jìn)一步測(cè)序，經(jīng)分析證實(shí)未出現(xiàn)移碼后，將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA后，采用RT-PER分析表明：該表達(dá)載體可用于介導(dǎo)NFAT2在Leydig細(xì)胞中進(jìn)行有效表達(dá)。將pEGFP-NFAT2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞，于36h時(shí)經(jīng)100nM皮質(zhì)酮

11、處理，48h時(shí)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)NFAT2在細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)現(xiàn)，Leydig細(xì)胞經(jīng)皮質(zhì)酮處理后，細(xì)胞內(nèi)的NFAT2從胞漿移向胞核。此外，我們將所構(gòu)建的pcDNA3-l-NFAT2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞后，經(jīng)G418加壓篩選，用RT-PCR和Western blot方法篩選陽(yáng)性克隆，獲得了能穩(wěn)定表達(dá)NFAT2的細(xì)胞株。 研究結(jié)果表明：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理后的Leyidg細(xì)胞，其中的NFAT2在細(xì)胞內(nèi)的定位有一個(gè)動(dòng)態(tài)變

12、化過(guò)程。而經(jīng)皮質(zhì)酮和CaN抑制劑CsA共同處理的Leydig細(xì)胞，其NFAT2仍停留于胞漿中，未出現(xiàn)向核內(nèi)移動(dòng)的現(xiàn)象，故不會(huì)引起FasL表達(dá)的上調(diào)?？梢?jiàn)，NFAT2在細(xì)胞內(nèi)的移位對(duì)其功能發(fā)揮起著重要作用。 第四部分：NFAT調(diào)控FasL的表達(dá)及其機(jī)制的研究 在上述三部分的工作中，我們證實(shí)了經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中有Ca<'2+>／CaN依賴的信號(hào)通路的參與(即：有增加的Ca<'2+>水平和CaN活性，NFAT2的

13、表達(dá)和增加的FasL表達(dá)量)。確定了經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中FasL啟動(dòng)子的核心調(diào)控元件。完成了對(duì)NFAT2活性的初步分析。在此基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步研究NFAT2是否確實(shí)參與對(duì)FasL表達(dá)的調(diào)控及其可能的作用機(jī)制。 本部分的內(nèi)容，一是證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子NFAT2在小鼠腫瘤Leydig細(xì)胞中有表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們首先利用穩(wěn)定表達(dá)NFAT2的細(xì)胞株作為細(xì)胞模型，觀察經(jīng)皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中FasL mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，

14、同時(shí)測(cè)定上述情況下細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示：經(jīng)皮質(zhì)酮處理后細(xì)胞株中FasL的mRNA和蛋白水平均顯著上升。皮質(zhì)酮和CsA共同處理組中的FasL mRNA和蛋白水平與未處理組相比則無(wú)顯著變化。Leydig細(xì)胞經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理12h，其凋亡率顯著增加，若將皮質(zhì)酮和CsA共同處理Leydig細(xì)胞，則凋亡率顯著減少，表明：NFET2參與了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細(xì)胞凋亡的過(guò)程。此外，采用RNA干擾技術(shù)評(píng)價(jià)在NFAT2的表達(dá)受到干擾的情況下，

15、檢測(cè)FasL mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)： NFAT2表達(dá)受到抑制后，經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理Leydig細(xì)胞中FasL的表達(dá)未呈現(xiàn)顯著上調(diào)。進(jìn)一步證實(shí)NFAT2參與了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的Leydig細(xì)胞凋亡的過(guò)程。 在證實(shí)了NFAT2對(duì)FasL表達(dá)具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，本部分的第二項(xiàng)內(nèi)容是進(jìn)一步評(píng)價(jià)有關(guān)NFAT2調(diào)控FasL表達(dá)的機(jī)制。我們采用共轉(zhuǎn)染和突變分析實(shí)驗(yàn)來(lái)研究在皮質(zhì)酮處理的Leydig細(xì)胞中，NFAT2是否通過(guò)調(diào)控FasL

16、啟動(dòng)子活性來(lái)控制FasL的表達(dá)。利用脂質(zhì)體將FasL啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體pGL3一FLP272一luc和NFAT表達(dá)載體pcDNA3.1-NFAT2瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞，經(jīng)熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)100nM皮質(zhì)酮處理12h的Leydig細(xì)胞，其熒光素酶活性與未處理組相比呈顯著增高，表明：NFAT2對(duì)FasL啟動(dòng)子具有明顯的調(diào)控作用。此外，我們?cè)O(shè)計(jì)了FasL啟動(dòng)子上NFAT結(jié)合位點(diǎn)的突變引物，用PCR方法，擴(kuò)增該突變片段，即：272b

17、p的FasL5’非編碼區(qū)片段，經(jīng)測(cè)序鑒定后，將其與pGL3一Basic載體連接，構(gòu)建FasL啟動(dòng)子上NFAT結(jié)合位點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告載體。利用脂質(zhì)體將pGL3一FLP272mut—luc和NFAT表達(dá)載體pcDNA3.1-NFAT2瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞，經(jīng)熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)皮質(zhì)酮處理12h的Leydig細(xì)胞，其熒光素酶活性與未處理組相比無(wú)顯著差別。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，NFAT2對(duì)FasL啟動(dòng)子具有顯著的調(diào)控作用。本文最后一部分